一、基本原理
生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來自縫隙的一束強光通過暗室時，可清楚地看到其中細微灰塵的現象是一樣的，即給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品上反射或折射的光進入物鏡，那麽，在漆黑的視野中，由於反差增大了，使樣品能夠看得更清楚。因用暗視野法可以在黑暗的視野中看到光亮的菌體，故在觀察生活細菌及細菌運動時常采用此法。
暗視野顯微鏡的構造主要是采用一種特殊的聚光器，在聚光器的下方中央為圓形黑盤所遮，光僅由周緣進入，使光會聚於載玻片上，並斜照物體，物體經斜射照明後，發出反射光可進入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無暗視野顯微鏡時，隻需將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下麵的濾光鏡支架上放一片星形擋板（star diaphragm）（圖Ⅲ-6）構成暗視野，這種方法適用於低倍鏡觀察。
在暗視野中，由於有些活細胞其外表比死細胞明亮，所以暗視野也被用來區分死、活細胞，此技術現已被用於各種酵母細胞的死、活鑒別。此外，暗視野顯微鏡對於觀察嬌弱的微生物，如梅毒密螺旋體（Treponema pallidum）特別有用。
二、器材
釀酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）；
暗視野顯微鏡，載玻片，蓋玻片，無菌水。
四、操作步驟
1．選厚薄在1．0—1．2mm的幹淨載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片（注意切勿有氣泡存在）。
2．將聚光鏡光圈調至1．4。
3．光源的光圈孔調至最大。
4．在聚光器上放一大滴香柏油，將標本置載物台上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不能有氣泡發生）。
5．用低倍物鏡及7×目鏡進行配光對準物體。調節聚光器的高度，首先在載玻片上出現一個中間有一黑點的光圈，最後為一光亮的光點（圖Ⅲ-7），光點愈小愈好，由此點將聚光器上下移動時均使光點增大。
6．換上所需目鏡和高倍鏡，緩慢上升物鏡進行調焦，至視野中心出現發光的樣品。
7．在蓋玻片上滴一滴香柏油，並將油鏡轉至應在位置調節配光，進行觀察。
四、注意事項
1．進行暗視野觀察時，聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿，否則照明光線於聚光鏡上麵進行全麵反射，達不到被檢物體，從而不能得到暗視野照明。
2．在進行暗視野觀察標本前，一定要進行聚光鏡的中心調節和調焦，使焦點與被檢物體一致。
3．由於暗視野聚光鏡的數值孔徑都較大（ NA=1．2—1．4），焦點較淺，因此，過厚被檢物體無法調在聚光鏡焦點處，一般載玻片厚度為1．0mm左右，蓋玻片厚度宜在0．16mm以下，同時載玻片、蓋玻片應很清潔，無油脂及劃痕，否則都會嚴重地擾亂最終的像。
五、實驗報告
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