軍團菌檢測方法
一、軍團菌簡介
軍團菌是一種環境感染性致病菌，可引起急性呼吸道傳染病，即軍團菌病。軍團菌分布極其廣泛，醫院、酒店等的供水係統、空調的冷卻係統等各種水源均易於滋生、汙染軍團菌，並造成軍團菌病傳染的風險。即與水有關的地方均可能存在軍團菌。軍團菌傳播、感染有以下特點：
1、透過空氣、水份感染，傳播帶季節性，超過50％病例在夏季發生。
2、滋生在醫院、酒店的供水係統，通過過水龍頭、浴室傳播。
3、可通過空調的冷卻係統，由通風口傳播並感染對象。
軍團菌屬革蘭氏陰性杆菌，專性需氧，無芽孢，無莢膜，軍團菌需要半胱氨酸和鐵，無半胱氨酸時，軍團菌無法生長。生化特征還有不發酵也不氧化糖類，不還原硝酸鹽，氧化酶實驗陰性或弱陽性，尿素酶陰性，軍團菌生長的最適pH為6.9-7.0，2％－5％CO2能促進部分菌株的生長。軍團菌生長緩慢，易於被其它菌落覆蓋。軍團菌的菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色。菌落整齊，表麵光滑，在紫外燈下，有熒光。軍團菌屬有41個種，61個血清型。侵肺軍團菌（Legionella pneumophila, LP）有15個血清型，是引起軍團菌病的主要菌型（占80%以上）。軍團菌病是一種急性呼吸道傳染病，臨床類型目前至少有肺炎型與龐蒂阿克熱型。本病主要為呼吸道飛沫(氣溶膠)傳播。目前尚無證據表明感染者、病人或感染動物作為本病的傳染源，通常把傳染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷卻塔、冷熱管道係統水等)作為傳染源。
二、軍團菌的檢測方法——ISO11731:1998
1． 範圍
本標準描述了一種用於軍團菌分離和估計環境樣品中軍團菌數量的培養方法。
該方法適用於所有環境樣本，包括飲用水、工業用水和天然水以及沉澱物、沉積物和粘土/軟泥等相關樣本。
2． 培養基和試劑
2.1 BCYE培養基(也可用硝酸鐵瓊脂代替)
2.2 BCYE-Cys(不含L-半胱氨酸)
2.3 GVPC培養基
2.4酸處理緩衝液
3． 取樣
3.1取樣容器
水樣可采用玻璃、聚乙烯或類似容器。以前用過的容器應該清洗幹淨、扣幹水分，121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經受高壓滅菌，應在高於70℃的流動熱水或流動蒸汽中處理至少5min。
3.2含生物防腐劑的樣品
如果水樣中含有或被認為含有氧化型生物防腐劑，應在取樣時或取樣前加入非活性試劑加以中和。如果水樣中含有消毒劑，需在采樣前或采樣後加入中和劑，含氯或氧化型消毒劑可用硫代硫酸鈉或硫代硫酸鉀作中和劑。
原則上講，實驗室接到水樣後應盡快進行微生物學分析，最好是取樣當天，尤其對於已知含生物防腐劑的樣品。因此，建議從樣品采集到製備好濃縮樣的間隔最好為2d，不應超過5d，最長不超過14d。
3.3樣品運輸
樣品應在6-18℃條件下被運輸，應避免熱和光照，最好在1d內，不超過2d將樣品送到指定實驗室。
4． 製樣
4.1 總則
如果液體樣品軍團菌的數量估計超過105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接塗布於GVPC平板。為了確保低於這個數量樣品中軍團菌的檢測，需采用濃縮技術。為了濃縮水樣，可采用膜過濾法（4.2）或離心法（4.3）。
4.2膜過濾法
如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的，應采用離心法。
采用膜過濾裝置進行膜過濾，采用直徑47-147mm，孔徑0.22μm和0.45μm的膜。過濾後的膜應放置在帶蓋的無菌容器中，可用無菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的無菌稀釋液或無菌去離子水，不斷搖動至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。
4.3離心法
取200ml樣品於300-500ml容積的離心瓶中，6000g離心10min或3000g離心30min，保持溫度在15-25℃，棄去上清液，將沉澱物懸浮在2-20ml無菌稀釋液或無菌去離子水中。
5． 培養
5.1將製備好的樣品（濃縮的或未濃縮的）分成3份，1份不做任何處理；1份進行熱處理；1份進行酸處理。
5.2熱處理
加1±0.5ml樣品於一無菌容器中，50±1℃水浴處理30±2min。
5.3酸處理
加1-10ml樣品於一擰蓋的容器中，6000g離心10min或3000g離心30min，用無菌槍頭吸去一半體積的上清液，通過渦旋重新懸浮剩餘物，用酸處理緩衝液補足原始體積。混合靜置5±0.5min。
5.4選擇性培養基的接種
分別接種未處理、熱處理和酸處理的樣品0.1-0.5ml於GVPC培養基上，熱處理和酸處理的樣品應在處理完立即接種，記錄接種體積。
5.5培養
翻轉平板，36±1℃培養10d。
5.6檢查平板
在10d的培養期間，用顯微鏡在2-4d內至少觀察3次，軍團菌生長較慢，很可能被其他菌掩蓋，記錄每一種菌落形態的數量。
注：軍團菌的菌落通常是白-灰-藍-紫，但也可能出現棕色、粉色、灰綠色或深紅色。軍團菌表麵光滑，邊緣整齊，出現典型的毛玻璃現象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色熒光；L.rubrilucens 和L.erythra呈現紅色；L.pneumophila菌落呈現暗綠色通常伴隨有黃色。熒光的顏色有助於區分樣品中軍團菌的不同種。為了避免軍團菌的死亡，不能將平板長時間暴露在紫外燈下。
6．可疑軍團菌的確證
6.1 BCYE和其他培養基的二次培養
從每個GVPC平板上至少選擇3個可疑軍團菌菌落接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊平板上進行二次培養，36±1℃培養至少2d。在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的被認為是軍團菌。通過血清學實驗（6.2）確證在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的菌落。
注：血瓊脂和營養瓊脂可以代替BCYE-Cys培養基。
6.2 直接免疫熒光抗體法（DFA）：優點是簡便、快速，缺點是敏感性低，且隻能用於Lp的檢測。
6.3 PCR及其相關技術：優點：有著更高的靈敏度和特異性，缺點：非特異性擴增 及交叉汙染。
附錄：
betway必威西汉姆联軍團菌檢測培養基
貨號 產品名稱 規格( g ) 價格（元） 產品說明及用途
HB8487 BCYE培養基 100 1600.00 用於軍團菌分離培養
HB8485 硝酸鐵瓊脂 250 150.00 用於軍團菌分離培養
HB8488 BCYE-Cys培養基 100 1600.00 不含L-半胱氨酸
HB8489 GVPC培養基基礎 100 1750.00 用於軍團菌選擇性分離培養
HB8489-1 GVPC添加物 1ml*5支 25.00 將5支試劑無菌添加於100mlHB8489中
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