A.3檢驗程序
A.3.1從菌株中檢測腸毒素從菌株中檢測腸毒素程序見圖A.1（略）。
A.3.2從食物檢樣中提取和檢測腸毒素
A.3.2.1微玻片法檢測腸毒素（濃縮法和層析法）程序見圖A.2（略）。
A.3.2.2酶聯免疫法檢測腸毒素程序見圖A.3（略）。
A.4腸毒素檢測
A.4.1從菌株中提取腸毒素方法
A.4.1.1液體透析培養法：用寬2.5cm、長80cm的透析袋裝入60mL產毒培養基，兩端紮緊，將透析袋裝入250ml錐形瓶內，加人15mL滅菌生理鹽水，透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高壓滅菌30min，待測菌株接種曹養瓊脂斜麵（試管18mm*180mm),37℃培養24h，用5mL生理鹽水洗下菌落，傾人上述培養瓶中，每個菌種種一瓶，37℃振蕩培養48h，振速為100次／min，吸出菌液離心，8000r/min3Omin，取上清液做雙相瓊脂擴散，如為陰性，再裝入透析袋內，用電風扇吹，或用多聚乙二醇，濃縮至1mL-2mL，再做瓊脂擴散。A.4.1.2固體透析培養法：向直徑150mm的滅菌平皿或帶蓋搪瓷盤中傾人滅菌產毒培養基約100mL——120ml，凝固後表麵鋪一滅菌玻璃紙，待測菌株接種在營養瓊脂上，37℃培養24h，用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒塗滿平皿，37℃培養48h，加人10mL——20mL滅菌生理鹽水，用滅菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液離心，以下步驟同液休透析培養法。
A.4.2從食品中提取腸毒素方法
A.4.2.1直接濃縮法：取食品樣品100g，加入無菌0.2mol/L pHI7.5磷酸鹽緩衝液，均質成勻漿，置4℃浸泡18h——24h，用紗布過濾將濾液離心8000r/min 20min．取上清液，放入分液漏鬥中，加人10ml三氯甲烷，振搖10min，靜置，將底層三氯甲烷棄去（如不分層，可8ooor/min離心20min）。加人6mol/l鹽酸溶液調pH至4.5,8O00r／min離心20min，取上清液，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調pH至7.5，離心取上清液，裝入透析袋或玻璃紙，用電扇吹幹，或放多聚乙二醇濃縮至1mL——2mL，做微玻片雙向瓊脂擴散。
A.4.2.2層析法：如需提取較純腸毒素，可將上述濃縮液用蒸餾水洗下，裝入透析袋，以0.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩衝液平衡，加人CM層析柱內，流速lmL/min——2mL/min，用0.008mol/LpH5.6磷酸鹽緩衝液洗脫，再用0.2mol/L pH6.8磷酸鹽緩衝液洗脫出腸毒素。洗脫液裝人透析袋內，用電扇或多聚乙二醇濃縮至1mL，做微玻片雙向瓊脂擴散，檢測腸毒素。
A.4.3雙向瓊脂擴散檢測腸毒素
A.4.3.1微玻片法：將在95％乙醇中浸泡的載片用潔淨紗布擦千，吸取溶化的0.2％瓊脂糖（蒸餾水配製）滴在載玻片上，使剩餘的瓊脂糖流下，放在無塵的環境中幹燥，先將一層薄塑料板放在載玻片上，然後將帶孔的有機玻璃模板邊緣塗一層薄的矽膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈係緊固定，吸取1%瓊脂糖，立即從模板中間孔加人載玻片和模板之間，直至充滿瓊脂糖，凝固後再將孔中瓊脂糖用注射器針頭挑去，在中間孔滴加抗血清，四周滴加菌株產毒液或食品提取液，放人加有濕棉球的容器內，放25℃一30℃、18h——24h觀察結果。可在燈光上，並對著暗的背景觀察，在抗血清和提取液之間呈現明顯沉澱線。如沉澱線隻能微弱可見時，可進行染色。
A.4.3.2玻片法：吸取溶化的1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔淨載玻片上．凝固後用直徑2.5mm的金屬打孔器打成幅射型，孔距為2.5mm，中心孔加人腸毒素抗血清，周圍六個孔加人菌株或食品的腸毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化鈉濕棉球的容器內，以保持濕度。置25℃～30℃、18h-20h，觀察結果，在抗血清的提取物之間有明顯沉澱線即為陽性。
A.4.3.3染色法；用微玻片法取下膠帶和有機玻璃摸板，玻片法可直接將玻片放人蒸餾水中浸泡4h-5h，中間換2次～3次水，在下述各液中浸10min，10％乙酸中含1％唾嚓紅R（或氨基黑）；1％乙酸；1％乙酸含l％甘油，如脫色不淨，可繼續浸泡。取出後蓋一濾紙，吸去多餘液體，在室溫或35℃烘幹。陽性者沉澱被染上顏色，可長期保存．
A.4.4酶聯免疫法檢測腸毒素（雙抗體法）
A.4.4.1包被抗體：用0.1m1/L pH9.5碳酸鹽緩衝液稀釋腸毒素抗血清使成5ug/mL，加人洗淨的苯乙烯凹孔板內，每孔0.2mL，置36℃士1℃30min，棄去上液。
A.4.4.2洗滌：用0.05％ 0.02mol/L pH7.2吐溫-20緩衝液洗滌五次。
A.4.4.3加人檢樣：如為液體，可直接加人0.2mL，固體樣品取100g，加人0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩衝液100ml，均質後取過濾液0.2mL。A.4.4.4洗滌：同A.4.4.2。
A.4.4.5每孔內加人酶抗體0.2ml，置36℃士1℃30min，同時做陽性和陰性對照。棄去上液。
A.4.4.6洗滌：同A.4.4.2.
A.4.4.7每孔內加人鄰苯二胺酶底物溶液0.2mL，室溫放置加而饑A.4.4.5每孔內加人2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶標儀比色。
A.4.4.9結果判定：樣品OD值比陰性對照，比值大於2為陽性，小於2為陰性。
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