果汁中嗜酸耐熱菌的檢測及控製
中國果菜2006年第2期China Fruit & Vegetable, Apr. 2006, No.2
丁辰1（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院）
上個世紀九十年代後期，隨著我國果汁工業的發展，特別是濃縮果汁出口量的日益增長，國際市場對中國果汁的質量要求愈加嚴格，不斷設置技術壁壘，果汁中嗜酸耐熱菌便是其中之一。最初，各果汁企業、研究檢測機構對這類微生物汙染都缺乏認識，難以在生產環節上對其控製。隨後的幾年中，我們通過加強與外商、國外研究機構的聯係溝通，接合果汁企業生產工藝，對果汁中這類微生物的來源及其對果汁質量會產生怎樣的影響，如何檢測、控製這類微生物等問題進行了深入地研究探索，協助眾多果汁企業改進生產工藝條件，使其產品中嗜酸耐熱菌得到了很好的控製。目前，絕大多數濃縮果汁企業的產品已能滿足外商對此項指標的要求。為了能使大家更好地認識、解決果汁中嗜酸耐熱菌這一技術難題，我們認為有必要對嗜酸耐熱菌的特征、檢測方法和工藝控製等方麵的工作進行總結，以便進一步統一認識，改進產品質量。
一、嗜酸耐熱菌的種類和特征
濃縮果汁一般具有較低的pH值、水分活性低、糖度高等特點，在果汁加工、濃縮過程中還要經過加熱處理，因此絕大多數的微生物都無法生存，隻有很少的細菌、黴菌和酵母可以在濃縮果汁中存活。嗜酸耐熱菌就是這少數細菌中的一類。在pH值較低時，嗜酸耐熱菌可以形成具有耐熱性的芽胞，果汁生產中常用的巴氏殺菌難以將其殺滅。它的芽胞以休眠的形式存活於濃縮果汁中，當果汁複水後，適宜的條件會使芽胞萌發、生長，從而導致果汁產品香氣損失、口感變差、濁度升高、形成沉澱。值得注意的是，嗜酸耐熱菌存在並不一定使產品變質，未變質的果汁中也能檢測到該菌，變質隻在適當條件下發生，一般會引起果汁香味損失及輕微渾濁。
1984年，有科研人員從巴氏殺菌後的腐敗蘋果汁中分離出一種嗜酸菌，該菌可以在26～55℃溫度範圍pH2.6～6.0的條件下生長，它的孢子具有極強的抗熱性，在較低的pH值時，工業巴氏殺菌後依然可以存活。1992年研究人員把這類嗜酸耐熱菌歸類於一個新的屬：genus．Alicyclobacillus。目前，該屬已知主要有三個種：Bacillusacidocaldarius，Bacillusacidoterrestris和Bacilluscycloheptanicus。
Alicyclobacillus屬的菌是嚴格的嗜酸菌，它們生長的pH範圍為2.0～6.0，生長溫度範圍為40～70℃，該屬菌需氧或兼性厭氧， 當環境和營養條件不利時可形成內生孢子。
Alicyclobacillus acedocaldarius為需氧的革蘭氏陽性杆菌，可形成內塵孢子，長2～3m，寬0.7～0.8rrm，形成5～6個細胞的短鏈。該種菌的孢子囊不膨脹，對熱的耐受能力較弱。該種菌的生長pH範圍為2.0～6.0，最適生長溫度為45～70℃，不需要生長因子。該種菌菌落扁平，邊緣不規則，不產生色素。該菌的主要來源為地熱環境。
Alicyclobacillus acidoterrestris為需氧的革蘭氏陽性杆菌，可形成內塵孢子，長2.9～4.3pm，寬0.6～0.8rrm，內生孢子為卵形。該種菌不需要生長因子，生長溫度範圍為35～55℃，最佳生 長溫度為42～53℃，可生長的pH範圍為2.2～5.8，在5%氯化鈉條件下不能生長。該種菌菌落圓形，黃白色，不透明或半透明。
Alicyclobacillus cycloheptanicus為可形成內生孢子的、需氧的革蘭氏陽性杆菌，細胞長2.5～4.5um，寬0.35～0.55rrm，孢子呈卵形，孢子囊輕微膨脹。該菌菌落圓形，較小，黃白色，不透明。該種菌生長需要生長因子，其生長溫度範圍為40～53℃，最佳生長溫度為48℃左右，可生長的pH範圍為3.0～5.5，生長於含氨基酸和糖類的培養基中。
二、果汁中嗜酸耐熱菌的檢測
文獻中培養、鑒別嗜酸耐熱菌的培養基有很多種，目前各企業常用的有YSG培養基、BSSA培養基、BAT培養基等。
BSSA培養基的主要成分為：CaCl2·2H2O 0.25g MgSO4·7H2O 0.50g ；(NH4)2SO4 0.20g KH2PO4 3.0g ；酵母提取物2.0g 葡萄糖1.0g ；可溶性澱粉2.0g 微量礦物質元素適量。
將各組分溶解於1000ml蒸餾水中，將培養基pH值調至3.7～4.0後，高壓滅菌。應注意的是，因為在較低的pH條件下，培養基中瓊脂的交聯度降低，難以形成固體培養基，所以要把瓊脂與其它培養基成分分開滅菌，使用前再混合。
由於常規果汁樣品中，嗜酸耐熱菌含量很少，因此多采用膜過濾法測定。取10克或10毫升果汁樣品加入到90毫升滅菌水中，混勻，在80℃水浴中保持10分鍾，以殺滅樣品中其它不耐熱菌，經0.45m膜過濾後，將過濾膜置於BSSA固體培養基上，45～50℃培養4天。對過濾膜上生長的菌落計數，即為10克(或 10毫升)樣品中嗜酸耐熱菌菌數。
對於不適合過濾的渾濁樣品，可使用BSSA液體培養基在50℃條件下增菌培養24小時，取1毫升增菌液於平皿中，加注BSSA固體培養基，於45～50℃培養4天，以判斷樣品是否為嗜酸耐熱菌陽性。
在嗜酸耐熱菌中，Alicyclobacillus acidoterrestris(AAT)為果汁主要有害菌，如何鑒別AAT是十分重要的，目前國處使用的AAT快速診斷法有RT-PCR法、過氧化物酶法等方法。其中過氧化物酶法已形成商業試劑盒。
過氧化物酶論斷的原理是：在培養基中添加vanillics酸，嗜酸耐熱菌可使vanillics酸產生大量的愈創木酚，在過氧化氫存在的酸性條件下，愈創木酚在過氧化物酶作用下可產生棕色化合物四聯愈創木酚。所以，可根據是否產生棕色合物來判斷是否AAT陽性。診斷視AAT含量不同，可在3-5小時內完成。
三、嗜酸耐熱菌的來源及控製
嗜酸耐熱菌廣泛分布於世界各地，在多種酸性食品中都有存在。嗜酸耐熱菌的根本來源為土壤，其在土壤中含量可達100cfu/g以上。水果表麵及果樹葉表麵也存在有嗜酸耐熱菌，但研究表明，雨後采摘的水果表麵嗜酸耐熱菌少於幹燥季節采摘的水果，這可能是由於雨水衝刷，雨後水果表麵灰塵少等原因造成的。
果汁加工廠中嗜酸耐熱菌的主要汙染來自原料果本身，對水果充分衝洗是減少加工早期階段菌數的有力措施。果汁加工的最初環節中，嗜酸耐熱菌控製的關鍵在於衝洗水的質量和有效衝洗，因此應定期檢測衝洗水中嗜酸耐熱菌含量，確定洗果池中洗果水適宜的更換頻率，延長流水噴淋時間，以確保衝洗幹淨。
果汁生產前期，加工溫度較低，嗜酸耐熱菌檢出量較少，生產後期，加工溫度升高，有利於嗜酸耐熱菌的生長。過濾前果汁中的嗜酸耐熱菌可以通過膜過濾去除。但有些企業往往在膜過濾後的產品中發現大量嗜酸耐熱菌，這多是由於生產線管路汙染造成的，因此必須控製好清洗用水的質量，加強加工生產線管路的清洗，采用適宜的清洗方法和清洗周期，以確保產品不發生嗜酸耐熱菌的再次汙染。
對於濃縮果汁中嗜酸耐熱菌的控製亦可采用瞬時高溫滅菌，但應注意控製好滅菌溫度和時間，不要影響產品的風味。
目前，我國濃縮果汁產品的國家推薦性標準中尚未對嗜酸耐熱菌提出限量要求，有的企業為了應對不同客戶的要求，要采用多種方法同時檢測嗜酸耐熱菌。我們希望能與各大果汁企業、檢測機構聯合，製訂合理、實用的統一檢測、控製方法，為企業降低檢測成本，增強出口果汁產品的競爭力，也為國家加強進口果汁產品管理提供依據。
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