一、準備工作
準備工作的內容包括器皿的清洗、幹燥與消毒，培養基與其他試劑的配製、分裝及滅菌，無菌室或超淨台的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試。
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）後接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。
理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用於培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材後應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少汙染可用抗菌素處理。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如係組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時後組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如係細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿並直接加入培養基。細胞進入培養器皿後，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。
正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無汙染，培養基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養進入培養後有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和遊走。過了潛伏期後細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底後要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮後分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般隻能傳幾十代，而轉化細胞係或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。
培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
四、凍存及複蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞碸或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存於液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。
複蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管後，立即放入37℃水中，使之在一分鍾內迅速融解。然後將細胞轉入培養器皿中進行培養。
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及複蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
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