細菌先經堿性染料結晶紫染色，再經碘液媒染（以增加染料與細胞的親和力）後，用酒精或丙酮脫色，再用複染色劑染色。不被脫色而保持原顏色者為革蘭紙陽性菌（G+）；被脫色後又被染上複染劑的顏色者為革蘭氏陽性菌（G-）。此法可將細菌分為兩大類。
革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用乙醇或丙酮脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染後的結晶紫和碘的複合物易於滲出，結果細胞被脫色，經複染後，又染上複染液的顏色；而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多且交聯度大，類脂質含量少，經乙醇或丙酮洗脫後，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此，細胞仍保留初染時的顏色。
【實驗材料、藥品及器具】
1、菌種：大腸杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylococeus auresu）
2、染液：草酸銨結晶紫液，革蘭氏碘液，95%的酒精，藏花紅液
3、器皿洗淨的載玻片6片、顯微鏡、酒精燈、接種環、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、鑷子、玻璃缸、瓶裝蒸餾水
【實驗步驟】
1、取培養12-24h的大腸杆菌、枯草芽孢杆菌和金黃色葡萄球菌分別塗片、固定。
2、加草酸銨結晶紫染色劑一滴，染色1分鍾。
3、傾去染液並用洗瓶裝水輕輕衝洗。
4、加碘液染1分鍾，水洗，然後用吸水紙吸幹。
5、將載玻片略傾斜，滴加95%酒精脫色（洗至流下的酒精中無紫色時為止），然後水洗。
6、加藏花紅複染，染色30分鍾，水洗，用吸水紙吸幹或烘幹。
7、用油鏡鏡檢觀察。
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