雙歧杆菌是專性厭氧菌,對氧氣非常敏感,因此,雙歧杆菌的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。
雙歧杆菌的最適生長溫度37℃~41℃,最低生長溫度25℃~28℃,最高43℃~45℃。初始最適pH 6.5~7.0,在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生長。其細胞呈現多樣形態,有短杆較規則形、纖細杆狀具有尖細末端形、球形、長杆彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形。單個或鏈狀、V形、柵欄狀排列,或聚集成星狀。革蘭氏陽性,不抗酸,不形成芽孢,不運動。雙歧杆菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光並具有柔軟的質地。雙歧杆菌是人體內的正常生理性細菌,定殖於腸道內,是腸道的優勢菌群,占嬰兒消化道菌叢的92%。該菌與人體終生相伴,其數量的多少與人體健康密切相關,是目前公認的一類對機體健康有促進作用的代表性有益菌。該菌可以在腸粘膜表麵形成一個生理性屏障,從而抵禦傷寒沙門氏菌、致瀉性大腸杆菌,痢疾致賀氏菌等病原菌的侵襲,保持機體腸道內正常的微生態平衡;能激活巨噬細胞的活性,增強機體細胞的免疫力;能合成B族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素;能控製內毒素血症和防治便秘,預防貧血和佝僂病;可降低亞硝胺等致癌物前體的形成,有防癌和抗癌作用;能拮抗自由基、羥自由基及脂質過氧化,具有抗衰老功能。
雙歧杆菌的培養方法很多,如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術該技術的優點是:預還原培養基製好後,可隨時取用進行試驗;任何時間觀察或檢查試管內的菌都不會幹擾厭氧條件。
近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學技術對雙歧杆菌進行基因指紋圖譜的構建,分析不同雙歧杆菌種間存在的同源性和多態性;RAPD技術也可用於雙歧杆菌菌種鑒定及分型。一般來講,我們都應用適合鑒定所有厭氧菌的方法,主要包括雙歧杆菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發酵試驗和其他相關指標等。
一、實驗方法
1、銅柱係統除氧
2、預還原培養基及稀釋液的製備
製作預還原培養基及稀釋液時,先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧,而後用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,一般瓊脂培養基裝4.5~5.0mL,稀釋液裝9mL,並插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最後變成無色,說明試管內已成為無氧狀態,然後蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,滅菌備用。
3、分離
(1)編號
取五支無菌水試管,分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
(2)稀釋
在無菌條件下,用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品,加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其混合均勻,製成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中,製成10-2稀釋液。依此進行10倍係列稀釋,至10-7,製成不同樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管計數。
(3)滾管分離
1)滾管
將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒溫的水浴中,待用,用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL,分別注入待用的試管中,然後將其平放於盛有冰水的瓷盤中迅速滾動,帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。
2)分離
生成的菌落需挑取出來,鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物,需再次稀釋滾管,並再次挑取菌落,直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定,做好標記。然後將培養基試管固定於適當的支架上,打開試管膠塞,同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時,另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內,找準待挑菌落,輕輕吸取,轉移至液體試管內,加塞。37℃培養。培養24h或待培養液混濁後檢查已分離培養物的純度。
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