摘要：本文就馬鈴薯莖尖脫毒技術、試管苗快繁、試管薯及微型薯生產及工廠化生產工藝流程等方麵，全麵總結近年來的研究結果。詳細描述馬鈴薯脫毒技術操作及試管苗、試管薯、微型薯工廠化生產各階段的技術要點和應注意的問題。
關鍵詞：馬鈴薯，脫毒快繁，工廠化生產
馬鈴薯種薯“退化”主要是由病毒引起的，通過莖尖分生組織培養及後期的良繁體係能夠獲得“無病毒”的“複壯”健康種薯。我國叢0世紀70年代初開始研究推廣這一技術，現已作為一種成熟技術被廣泛應用，實踐證明用高質量的脫毒種薯可使產量增加30%-50%。馬鈴薯脫毒快繁技術，包括脫毒材料的選擇，莖尖分生組織培養，試管苗的快速微繁殖，試管薯的誘導，人工隔離條件下的扡插生產微型薯，以及天然隔離條件下的各級脫毒種薯生產。
1 脫毒材料的選擇 對準備進行脫毒複壯的馬鈴薯品種，或材料進行田間株選和薯塊選擇是非常重要的。它不僅能提高脫毒效果，而且直接關係到經過脫毒後的材料能否應用。
1.1 田間株選 田間株選要注意以下幾方麵的問題：
（1）所選的植株必須符合品種的特征，包括株型、葉形花色等生物學性狀及成熟期等農藝性狀。
（2）植株生長健壯，無明顯的病害症狀，包括病毒病、真、細菌性病害。
（3）適時早收。選相對單株產量及大薯率高的單株。
1.2 塊莖選擇 選符合品種特征的薯塊，包括皮色、肉色、薯型、芽眼等、無病斑、蟲蛀和機械創傷的大薯塊作脫毒材料。
1.3 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測 馬鈴薯紡錘塊莖病（Potato spinde Tuber Viroid 馬鈴薯紡錘塊莖類)是由類病毒引起的，類病毒上一個沒有蛋白質衣殼的小分子量核酸，它也是引起馬鈴薯“"的一重要病害，它的弱病係可造成20%-35%的減產，強係可減產60%。
由於馬鈴薯紡錘塊莖類病毒在目前用植物莖尖分生組織方法極難脫除，在進行脫毒前，首先要對入選的塊莖進行馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測。淘汰帶有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒塊莖，選用不帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的塊莖進行脫毒，否則脫毒後仍帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。
2 莖類脫毒 2.1 催芽及溫度處理 （1）催芽，入選的塊莖用15硫脲+5mg/L赤黴素浸種5分鍾，以打破休眠。用溫潤沙覆蓋，置於25℃黑暗條件下催芽。
（2）材料消毒，待長到2CM時，用70%酒精過一遍，隨即用5%-7%次氯酸鈉溶液浸20分鍾，然後用無菌水衝洗3-4次，剝取莖尖。
（3）莖尖培養，第一次剖取1MM以上的大莖尖，進行離體培養。培養基MS+蔗糖3%、瓊脂0.7%、PH5.8。待莖尖長至1CM時，轉入光照培養箱，以每天16小時光照，（36±1）℃的高溫處理6-8周。高問處理有利於鈍化病毒，提高脫毒效果。
2.2 莖尖分生組織培養 經高溫處理後的苗，在實體解剖鏡下，剖取帶有1-2個葉原基（約0.2-0.3毫米）的莖尖分生組織，進行離體培養。莖尖分生組織，處於分化的初級接，其初期維管還未與莖內的主維管相聯通。此時植物體體內的病毒顆粒，隻能通過細胞間連絲移動到分生區，而這一移動過程遠不及細胞分裂的速度，利用這一特點，加之熱處理鈍化病毒活性，提高植株生長速度。剝取莖尖處0.1-0.5毫米分生區的細胞組織，進行離體培養，就可得到無病毒植株。從莖尖剝取的分生組織實際上隻是剛開始分化的大細胞團，因而培養過程中應更加精心看護，注意培養基的成分和胚芽功能環境。
莖尖分生組織培養基，MS+赤黴素0.mg/L+6-苄胺基嘌呤0.1mg/L+D-泛酸鈣0.2mg/L+蔗糖2%,瓊脂0.7%,PH5.8。培養條件（23±2）℃，16小時光照，光強2000m燭光。 ℃經
經高溫處理後，進行莖尖分生組織培養，可脫除馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯雜斑病毒及馬鈴薯A病毒，但不能脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。
2.3 病毒檢測 由莖尖分生組織培養獲得的試管苗，經第一次擴繁後，需對試管苗進行病毒檢測，隻有經病毒檢測後，確認是不帶病毒的株係，才能進一步利用。對帶有病毒的株係，可以淘汰，或進行再次脫毒，試管苗病毒檢測，采用酶聯血清檢測，配合指示植物及電鏡觀察完成。根據黃楚材等人（1980）的研究，馬鈴薯X病毒和S病毒離生長點很近，莖尖剝取長度須在0.2MM以下，Y病毒等離生長點較遠，莖尖切取0.3-0.5MM就可以去掉，認為X病毒脫去與否是該植株有無病毒的重要標誌，因此應特別注意對X病毒的檢測。在全世界已報道了的30多種侵染馬鈴薯的病毒，類病毒和類菌體中，我國隻有馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯M病毒、馬鈴薯卷葉病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒分布廣泛，危害比較嚴重（張鶴齡，1992）。因此我們對試管苗的病毒檢測的重點應放在上述幾種病毒上，特別是馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒。
2.4 試種觀察 經病毒檢測後確認不帶有病毒的試管苗在進一步大量擴繁前，還需進行試種觀察，即將每個無病毒株係的試管苗取出一部分移栽到大田試種、觀察、檢驗其是否發生變異，是否符合原品種的全部生物學特性及農藝性狀。莖尖分生組織是一個分裂很強的新生細胞組織，在培養過程中，極易因外界條件的改變發生變異，特別是當培養基內含有外源激素參與時，這種可能性就更大，這也就是育種學家常說的發生芽變，但在脫毒過程中，發生變異現象是不利的。另外在我們剝取莖尖分生組織時，由於細胞組織太小，因而也有可能取到的組織是不帶有本品種全部遺傳基因的嵌合體組織，由它進一步培養，產生的種薯就不會於原品種完全相符，這些株係都屬淘汰之列。根據德國Bioplan公司的研究表明，這種變異發生率很低，在1987-1993年中經莖尖脫毒而發生變異僅有一個葉色變異的株係。
對於要進行大量擴繁的無毒株係，在擴繁以前，都必須經過田間試種，檢測其所有性狀，淘汰變異株係，將符合原品種特征、特性的株係，進一步擴繁利用。
3 脫毒試管苗快速微繁殖 馬鈴薯是一種再生能力很強的植物，對培養條件的要求不太嚴格，但若要獲得健壯的試管苗及高倍的繁殖速率，則需對馬鈴薯試管苗生長所需的營養成分、培養條件以及影響試管苗微繁殖速率的一些因素有個較全麵的了解。
3.1 培養條件 快繁用培養基：MS+蔗糖3%，瓊脂0.7%，PH5.8，在培養基內加入活性炭可提高莖的生長速度，有利於試管苗葉片伸展及壯苗，一般用量為0.3%。
試管苗生長過程中，由於外界環境的影響，或因早期使用激素而產生的後效應，往往易形成莖杆細弱，葉片小、節間長的徒長苗，這種苗在試管微繁殖過程中，一般不影響繁殖速率，但對後期進行試管薯誘導或溫室移栽則影響很大，特別是移栽不易成活。防止試管苗徒長，可以通過對外界培養環境的調整也可以用植物生長延緩劑，通過生理調節來解決，試驗結果表明：多效唑、矮壯素、比久三種試劑加入在培養基內效果好，它能使莖加粗、節間變短，葉片大而厚，植株生長健壯。馬鈴薯試管苗生長與田間植株生長一樣，有一定的晝夜溫差有利於苗的健壯生長。對培養條件的要求為白天25-27℃，夜間16-20℃光照16小時，光強2000M燭光以上。
3.2 繼代次數及繁殖速率 試管苗一般每間隔25天切轉一次，擴繁率一般為3-6倍。從理論上推算，按一年繼代12次，每次平均擴4倍，1株試管苗一年後可擴繁至16777216株，由此可見試管苗微繁殖的潛力很大，但是由於設備條件和技術上的原因，在實際操作時遠達不到這種繁殖速率。在一間可控溫的16平方米培養室內（可放置7個架子，每架6層，每層可放置100ml三角瓶128個，按每瓶裝8株試管苗每年切轉10次計）可年產試管苗43萬株。
長期繼代培養的試管苗有可能再次染上病毒，據王軍（1992）報道試管苗在寄代培養兩年後，均發現有不同程度的病毒和細菌侵染，馬鈴薯X病毒80%，馬鈴薯Y病毒52%、馬鈴薯卷葉病毒46%、馬鈴薯M病毒20%，隻有經過再次莖尖脫毒才能複壯更新。細菌的侵染主要是由於操作的不精心所致，而病毒的再現可能有三方麵的原因，一是脫毒不徹底，脫毒後試管苗血清檢測沒有病毒反映，上因為植株體內病毒含量非常少，以致檢測不到，試管苗多次繼代後，病毒逐漸積累，從而再次出現病毒侵染；二是一些弱係病毒或一些暫時沒有條件檢測到的病毒，在強係病毒脫到後快速繁殖造成危害，三是由於操作及其他一些原因造成的病毒再次侵染。
試管苗，在離體條件下多次繼代，特別是長期生長在高激素含量的培養基中，還會引起芽變的可能。因此，馬鈴薯脫毒試管苗組培快繁，需兩年更換一次基礎苗，以提高試管苗的質量。為延長脫毒後的試管苗使用壽命，可采取擴繁初期分出一部分苗，轉入保存用培養基，並給予有利的保存條件，每6-8個月切轉一次苗，這樣可以大大減少周轉次數及汙染機率，等快繁繼代2年後，用保存苗替代，這樣由兩年更新脫毒一次，可延長到4-6年甚至8年才需脫毒複壯一次。長期處於抑製生長條件下的保存試管苗，是否會發生變異或其他生理上的不利影響，有待於進一步研究。保存苗在使用前仍需進行一次病毒檢測及田間試種觀察。保存苗培養基：MS+甘露醇4%，蔗糖3%，瓊脂0.7%，PH5.8。
3.3 培養器內微環境調控 馬鈴薯是喜光和呼吸強度比較高的作物，培養器內濕度及二氧化碳濃度直接影響試管苗的生長，可以通過瓶口覆蓋物進行調節。瓶口覆蓋物透氣性好的如棉塞、封口膜對試管苗生長有利，而透氣性差的覆蓋物，會使試管苗生長細弱，並內產生大量的氣生根。當培養室溫度高於27℃時，易產生莖尖枯死現象。
培養瓶的大小，對試管苗的生長及繁殖率都有很大的影響，從試管內二氧化碳濃度測定及植株鮮重增長量的分析結果，可以看出培養瓶越大，越有利於試管苗的生長。綜合試管苗生長勢、繁殖率、汙染率以及培養成本（培養基用量、消毒費、人工費等）分析，以用100-150ml培養瓶，繁殖馬鈴薯試管苗比較合適。
3.4 真、細菌汙染是植物組織培養過程中，普遍發生的問題，控製不好很容易形成毀滅性的災難，特別是夏季陰雨天氣空氣濕度大，真菌孢子、細菌在空氣中的含量很高，傳播很快。必須作到提早預防及時控製。 （1）要嚴格按操作規程作業，盡可能減少人為汙染。試管苗切繁采用剪刀瓶內切段，瓶對瓶接種方式，減少汙染機會。
（2）工作人員應堅持每天巡視培養室發現汙染瓶及時取出培養室。
（3）降低培養室濕度，可采取安裝空調或除濕機的方式，使空氣相對濕度降低到60%以下，特別是在陰雨季節，更應注意除濕，以防汙染大流行。
（4）一旦發生汙染大流行，要在清除全部汙染源的同時，將培養室通風換氣，並采用酒精噴霧、紫外燈殺菌。必要時可采用多菌靈等殺菌煙霧室內殺菌。
（5）對十分珍貴的材料，或由於汙染瀕臨滅絕的材料，可用青黴素或鏈黴素20萬單位，救由於細菌汙染的材料。用多菌靈5mg/L加入培養基內，救助由於真菌引起汙染的材料。不同品種對這些殺菌劑的適應性不同，使用前最好做一下試驗，以免珍貴材料丟失。材料在含有殺菌劑的培養基上培養一段時間後必須及時轉回到正常快繁培養基，以免影響試管苗的生長。
3.5 降低成本 馬鈴薯試管苗組培快繁，試劑用量很大，成本相對較高，如何能降低成本，是大家所關心的問題。
（1）培養基的簡化 馬鈴薯試管苗快繁培養基，可以全部減去MS培養基養分組成中的各種有機物。隻用其大量元素和微量，可以選用化學純以下級別的試劑來代替。作為碳源的蔗糖和蒸餾水是組培快繁中用量較大的，試驗證明，以市售的食用白糖替代化學純蔗糖，以軟化後的自來水（白開水）代替蒸餾水用於試管苗快繁，對試管苗生長無副作用。
（2）該固體培養為液體培養 作為組培快繁培養基中重要角色的瓊脂，是培養基所用各種試劑中成本比重最高的，約占26%以上。在試管苗組培快繁時，可以采用液體靜止培養，代替現行的固體培養，去掉瓊脂，能大大降低培養基成本，同時由於操作簡單可提高切轉效率。一般選用250ml三角瓶，每瓶裝液體培養基20ml，接種莖段15-20個，試管苗靠葉片浮在培養基表麵。操作時應注意盡可能避免對培養瓶的震動，以防新接莖段完全淹沒在培養基內，因窒息而死。液體培養植株生長快，繁殖率高，但容易發生細菌汙染蔓延，應及時防止。
4 試管薯誘導 馬鈴薯試管薯誘導，應注意下麵幾方麵的問題。
4.1 培育壯苗 培養出健壯的試管苗，做誘導材料，是試管薯誘導成敗的關鍵，隻有在誘導結薯前一個階段中培養出根係發達莖杆粗壯，葉色濃綠的試管苗，才能獲得高產、優質的試管薯。
（1）優良株係的選擇 同一品種的試管苗，不同株係之間在相同的培養條件下，其生長勢及植株在試管中表現不一樣，有的株係長勢就細弱，而有的株係植株就表現的非常強壯，不同株係在相同的誘導條件下試管薯的結薯率及薯重有很大的差異。這可能是由於不同株係內生理代謝略有差異造成的。因此在試管薯誘導之前有必要對誘導材料加以篩選。
（2）壯苗用培養基 作為誘導前培育壯苗的培養基一般為更換培養基的方麵，多采用液體靜止淺層培養，常用的培養基有MS+食用白糖3%+活性碳0.15%，PH5.8和MS+食用白糖3%+比久3mg/L,PH5.6，視苗生長情況而選擇使用。將帶有2-3個莖節的試管苗，丟掉頂芽（以利同步生長）接種在液體培養基上，靜止培養，3-4周後每個莖段發育成一株具有5-7個節的健壯苗，換成誘導結薯培養基，3-4天後試管內開始有試管薯形成。
（3）培養條件控製 壯苗培養溫度以白天23-37℃，夜16-20℃為宜，晝夜有一定的溫差有利於試管苗的生長。馬鈴薯是喜光作物，光周期和光強對馬鈴薯試管苗的生長有很大影響，16小時的長光照及增加光強到4000M燭光以上，有利於試管苗的健壯生長，培養瓶要選用透氣性好的封口物，以利氣體交換，促進壯苗的形成。
4.2 試管薯誘導 （1）誘導培養基 常用的誘導馬鈴薯試管薯的基本培養基為MS培養基，胡運海等的研究證明，降低培養基中的總氮水平和硝態氮的比率有利於提高微型薯的成薯率。因此也有選B5培養基為基本培養基的，因為B5培養基中總的氮素水平特別是硝態氮的水平較低。
關於誘導結薯的培養基中是否加入植物激素。王軍（1992）認為，隻要誘導結薯的環境條件適宜，植物體內能夠合成足夠的內源激素或結薯刺激物，那麽任何外源生長調節物質都可以取消。根據作者的試驗結果來看，王軍的觀點是對的，但是，沒有外源誘導激素參與、結薯慢且單株結薯率及薯重都低於有外源激素參與的處理。為了能在短期內大量生產高質量的試管薯，6-苄胺基嘌呤和矮壯素作為誘導劑是必要的，至少在沒有完全了解試管薯發育機理並尋找出更有效的誘導方法之前是這樣。試管薯誘導培養基MS+6-苄胺基嘌呤5mg/L+矮壯素500mg/L，食用白糖8%，PH5.8。更換誘導培養基時，最好將培養憑內原有的壯苗培養基去掉以利結薯。
（2）誘導試管薯的環境條件 Simmon(1989)、李燦輝（1990）等試驗表明，在誘導結薯階段每天予以8小時的光照處理，可以顯著提高試管薯的產量和質量。我們的試驗中在8小時光照下形成薯塊的時間明顯晚於暗培養，而總結薯塊數沒有明顯優勢。現在采取的培養方式為：當加入誘導培養基後繼續在16小時光照條件下培養3天轉入暗培養，能提高試管薯結薯率。培養溫度20℃，若用密封式人工培養箱暗培養，每天要開一次培養箱的門更換培養箱內空氣，以利塊莖的發育。
4.3 生長周期 試管薯誘導周期為50-60天，即試管苗莖段接種到壯苗形成位5-30天，誘導培養開始到收獲25-30天。采用50ml三角瓶每瓶15個芽段，一次可收試管薯20-30粒，多者可達50粒以上。
試管薯收獲後要用清水多次衝洗。用濾紙吸去表麵的水，置於4℃冰箱保存，待其自然通過休眠後，取出播種。由於試管薯水分含量大，體積相對較小，儲存過程中應注意保水分。
5 扡插生產微型薯 扡插生產微型薯是在人工隔離條件下保護地進行的。
5.1 基礎苗栽培 將試管苗切成帶有一個芽的莖段，轉入生根培養基一周後小苗長成帶右4-5片葉及3-4條小根的健壯苗，移栽前去掉試管封口，鍛煉兩天，即可移栽，在溫、濕度條件合適時移栽成活率可達90%以上。生根培養基1/2MS+吲哚乙酸0.2mg/L+食用白糖2%+瓊脂0.7%，PH5.8。
移栽苗基質：蛭石：草炭：消毒田園土=1：1：1，每立方米基質加入2KG磷酸二銨做基肥。移栽初期應覆蓋塑料薄膜及遮蔭網紗以保持濕度及防止強光直射。散射光利於緩苗，1周後幼苗長出新根，可逐漸去掉薄膜及遮蔭網紗。待苗長至5-8片葉時即可進行第一次剪切，以後每20天可剪切一次。基礎苗一般栽植密度為每平方米800株。
基礎苗管理：每次切剪後，需噴施10ml/L赤黴素及營養液一次，平時每隔一天澆一次水。營養液：可以用MS基本培養基中的無機鹽代替。
5.2 扡插生產微型薯 有基礎苗上剪切苗的頂部，一般帶有2-3片葉，在生根劑中浸2分鍾，扡插於基質中。扡插的基質及插後苗初期管理與基礎苗移栽時相同，扡插密度為每平方400株。生根劑：吲哚丁酸200mg/L+赤黴素5mg/L。
扡插苗長至10片葉以上時，苗基部要覆一次基質土，以利結薯，後期若有徒長現象，可噴施100ml/L矮壯素，以抑製生長，促進塊莖膨大。
扡插後45-60天可收獲，每株結薯1-3個，單個重0.5g以上，最大塊莖重20g。每次每平方米可收獲500-600塊。
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