突變導入克隆病毒DNA的方法

將突變導入克隆病毒DNA的方法概括起來有三類：堿基置換；缺失或插入；成簇堿基(或短序列)置換。

堿基置換法最簡單的堿基置換為寡核苷酸指導的突變法，該法需要合成一個含有目的突變的寡核苷酸序列作為引物。將其與含有野生型序列(通常為經M13噬菌體製備的單鏈DNA)模板雜交，然後以DNA聚合酶延伸，產生含有錯配堿基的異源分子。在大腸杆菌中這一錯配堿基得到修補而“固定”下來。這一方法能精確地產生所需突變，因此可用於改變病毒蛋白編碼序列上的單個密碼子，或在具有調控功能的病毒基因組序列上造成特定突變。除了單個堿基置換外，還可在一小段克隆的病毒DNA上隨機產生多個堿基置換，方法有多種：簡並引物法 基本上同上述寡核苷酸指導的突變法，不同的是所用引物帶有多個隨機堿基置換；也可用合成的雙鏈寡核酸取代目的片段，其法類似於下述的成簇堿基置換。化學誘變法1 以化學誘變劑處理雙鏈DNA，這是最簡單的定位隨機突變法。如用亞硝酸、羥胺等處理目的DNA片段，然後將其與野生型的其餘部分連接起來，在隨後的DNA複製中產生突變。化學誘變法2 利用化學誘變劑(如亞硝酸、甲醛、肼)處理單鏈DNA，這些試劑修飾單鏈上的堿基，而不至使磷酸二酯鍵骨架斷裂。在用通用引物，禽反轉錄酶作用下，合成互補DNA鏈，因修飾堿基而發生配對改變導致隨機突變。由於每一個位置上都可能有4種堿基，每一個修飾位點上的突變率為75%，同時由於顛換是轉換的2倍，最終的突變將產生具有廣泛氨基酸改變的蛋白質。DNA聚合酶錯誤摻入法 可以應用各種DNA聚合酶摻入堿基類似物這一途徑向雙鏈DNA導入點突變。硫代磷酸dNTP可經聚合酶有效地摻入，但不易被3'→5'編輯功能去除，可用DNaseⅠ首先在目的DNA上造成裂隙，在隻有硫代磷酸dNTP的條件下進行一次聚合反應，隨後再在有4種正常dNTP的條件下進行第二次聚合反應填補剩餘裂隙，這種方法獲得多種類型的堿基置換。也可以應用缺乏3'→5'外切酶活性的反轉錄酶完成錯誤摻入，產生隨機突變。

缺失和插入法 最簡單的人工突變就是在克隆的病毒DNA序列上產生一段缺失，若病毒DNA的限製性酶切圖譜已經清楚的話，則有可能通過適當的限製酶建立一係列不同的缺失突變株。將兩個限製性酶切位點間的序列切除，再以連接酶連接起來，即可達到目的。此時，若酶切產生的末端為平端或相同的粘性末端，可以直接連接起來，但若為不同的粘性末端，則需借助於E.coli DNA聚合酶Ⅰ Klennow片段，S1核酸酶等修飾酶處理以產生可經DNA連接酶連接的平端。同樣的方法可用於在特定的限製性酶切位點處或之間插入一段異源性序列。　　為了研究某一核苷酸區域的功能，往往需要缺失或插入不同長度的序列，這時有多種方法可以應用：接頭插入法 用胰DNaseⅠ部分酶切或限製性內切酶部分酶切雙鏈螺旋重組DNA分子，使之線性化，然後將人工接頭連接於末端，即造成含有人工接頭插入的突變。套式缺失突變法 有多種方法可以產生從目的DNA一端或另一端連續缺失不同大小片段的套式突變，這些方法均取決於以預期方式消化DNA的核酸酶：BAL31、胰DNaseⅠ、核酸外切酶Ⅲ。它們各有優缺點，但以核酸外切酶Ⅲ最為理想。