新型可複製型疫苗
(1) 基因缺失型弱毒疫苗：通過非天然宿主傳 代選擇得 到的突變株，其基因組可能發生了多個突變，因此對其致弱的遺傳基礎無法確定。 隨著分 子病 毒學研究的不斷深入，人們發現某些病毒 的 毒力或毒力相關基因與病毒複製無關，造成該基因的缺失突變後，其毒力喪失或明顯減弱， 但病毒複製能力並不喪失， 同時保持著良好的免疫原性。因此通過基因工程技術造成病毒 基因組中 負責毒力的基因缺失而製成的疫苗稱為基因缺失型弱毒疫苗。造成病毒基因缺失的 方法， 是首先在體外利用限製性內切酶對含有毒力基因的部分病毒DNA基因組進行酶切, 然 後再通過同源重組的方法構建成缺失型病毒株。對於由正鏈RNA組成的病毒基因組, 必需 先轉錄成cDNA，然後才能進行酶切和同源重組操作。由負鏈RNA組成的病毒基因組 目前尚不能進行類 似操作，因為人們還不能成功地將病毒cDNA轉化為具有感染性的負鏈RNA病毒。 缺失可以是一個基因的全部，或是一個基因的部分；也可 以是兩個基因或其部分缺失, 通過兩個缺失基因的協同作用使病毒致弱; 還可以是非編碼區 基因的缺失。 采 用缺失的方法可 能會製造出免疫原性好，且在安全性上更有保證的弱毒疫苗株，也可以改造現行的免疫原性 還不能令人滿意的弱毒株以增強其安全性。將多瘤 病毒基因的部分早期區造成缺失後，用該突變株感染乳鼠，複製水平是野生型病毒的 1%～１０%，而在體外細胞培養物上，突變株和野生型病毒之間滴度無明顯差異, 但是缺 失突變株不象野生型病毒那樣，前者不引起乳鼠的持續性感染。說明在病毒基因組的 適當區域內造成缺失後， 病毒在體內的複製受到限製，但對其在細胞培養物上的生長無任 何影響, 同時降低了其致病性。 單純皰疹病毒(HSV)是構建缺失型疫苗的首選病毒之一。目前對HSV基因組的結構及其功能 已經比較清楚 ，可以通過選擇性地滅活特異性基因達到致弱目的。如將HSV1和HSV2的22基因缺失後， 對小鼠的神經毒性明顯降低。近年來人們進一步把該病毒的胸腺激酶 基 因(TK)缺失掉，這樣不僅降低了毒力，而且在接種小鼠後，能夠保護小鼠抵抗野生型病毒的 攻 擊。牛皰疹病毒1型(BHV1)TK基因缺失疫苗於1984年首先在美國報道，采用鼻內、肌肉 及靜脈內試用接種均無致病性，其唯一的缺點是疫苗病毒具有潛伏性。1994年澳大利 亞學者Smith構建了一株BHV1的TK基因缺失株，肌肉和靜脈注射後，能誘導機體產生良好 的免疫反應，且無明顯的副作用。偽狂犬病病毒TK疫苗已於1986年獲美國農業部動植 物 檢疫總署批準投放市場， 並在此基礎上，研製出缺失主要膜糖蛋白gpⅢ區的第二代缺失型 疫苗株。目 前已經得到廣泛應用。美國提出了要在2000年消滅偽狂犬病的目標。國內也在開展 類似缺失型疫苗的研製工作， 雞傳染性喉氣管炎病毒的缺失株亦在構建中。此 外，由於許多從RNA病毒獲得的cDNA具有感染性，人們預測RNA病毒缺失株的研究也將逐步開 展。由於缺失型疫苗是人為地將病毒的毒力基因切除，往往不可能完全自行修複，因而不 會發生返祖 現象，在遺傳特性上比較穩定，是今後弱毒疫苗的研究方向之一。
(2)插入突變株: 在 病毒基 因組內插入一定數量的堿基或核酸片段，可能造成毒力基因的活性喪失。 但插入的核酸片 段可 能出現丟失現象，使病毒的毒力回複。 有報道在病毒基因組中插入白介素2等 基 因。如在痘苗病毒基因組中插入白介素2基因降低了其對實驗小鼠的致病性。插入的蛋白 可能起類似於IFN的作用，導致重組病毒的複製能力降低。IFN基因插入後 可能也會對病毒毒力具有一定致弱作用。
(3)病毒載體活疫苗: 在某些病毒的基因組內有一些核苷酸序列(如痘病毒的TK基因，腺病毒 的E1和E3區等), 將其 切除或突變或在該區域內插入外源性基因片段後, 均不影響病毒的複製, 是病毒的複製非必 需區。利用基因工程的方法，可以將該複製非必需區克隆出來，經過體外改 造後，將異源性病毒的保護性抗原基因及啟動子調控序列等插入其中，再通過體內同 源重組技術， 獲得重組病毒, 利用該重組病毒接種動物後，不僅可以誘導機體產生針對異源性病毒的 特異性免疫反應，而且在采用宿主特異性載體病毒時，能夠使宿主獲得針對與載體病毒 相應的強 毒株的免疫力，如果在載體病毒中同時 插入多個異源性病毒的保護性抗原基因就可以達到 一針防 多病的目的。這樣的基因工程重組疫苗稱為病毒載體活疫苗。 目前用於表達外源性病毒蛋 白的載體病毒包括痘病毒(痘苗病毒和宿主 特異性痘病毒)、腺病毒、皰疹病毒和小RNA病毒等。痘苗病毒具有宿主範圍廣、增殖滴度 高、 穩定性 好、 基因組容量大、含多個非必需區等特點，因此，有利於進行基因工程操作和適於插 入多個外源 基因。同時，痘苗病毒經過在人體內長期使用後證明其抗原性穩定, 免疫原性持久，能夠同 時 誘發體液和細胞免疫, 相對安全。 因此是研究最早和最成功的載體病毒之一。 但是痘苗病 毒 在種痘後局部反應較大，在人接種後有百萬分之一發生全身性發痘和種痘後腦炎等並發症傾 向。近年來針對痘苗病毒的某些不足之處，相繼開展了雞痘病毒、金絲雀痘病毒、豬痘病毒 、羊痘病毒以及兔痘病毒載體的研究，並取得了良好的進展。尤其是禽類痘病毒, 由於用該 病 毒接種哺乳動物後, 可以引起頓挫型感染, 但卻可以持續表達外源基因, 並且 不影響再次接種, 日漸引起人們的關注。
在進行痘病毒載體構建時， 主要應考慮以下因素:
①啟動子。 痘病毒與其它大多數DNA病毒不同，是在胞漿內複製，病 毒DN A轉錄時，必需靠其自身合成的RNA聚合酶，因此在痘病毒內表達外源基因時，必須使用痘病 毒自身的啟動子，在痘苗病毒和禽痘病毒載體構建時，外源基因前多使用來自於痘苗病毒的 早期啟動子P7.5，或晚期啟動子PL11；
②外源病毒結構蛋白基因。 由於痘病毒不具有編接 機 製, 外源病毒結構蛋白基因應為其連續編碼區，不能有內含子或間隔區；
③終止子。 為了 不影響痘病毒載體基因的正常表達，在使用早期啟動子時，在3’末端加上早期基因轉錄終 止子T5N T；采用晚期啟動子時不必考慮終止子問題，晚期啟動子的轉錄可在痘病毒基因組中被終止 。痘病毒不識別其它真核基因的轉錄終止子；
④非必需區同源序列。 由於將外源性病毒基 因導入痘病毒的機理是同源重組, 因此，在構建載體時，必需在外源目的基因及啟動子兩側 帶有痘病毒基因組的同源序列，同源序列一般取自於病毒複製非必需區，這樣可以保證 病毒的複製能力不受影響。迄今在痘苗病毒或其它痘病毒載體中表達的動物病毒保護性抗 原有狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白、禽流感病毒血凝素、傳染性法氏囊病病毒VP2、雞新城疫 病毒 血凝素蛋白和融合蛋白(F)、馬立克氏病毒糖蛋白B(gB)、脾壞死型禽網狀內皮組織增生症病 毒、 雞傳染 性支氣管炎病毒纖突蛋白、牛水泡性口炎病毒糖蛋白以及豬偽狂犬病病毒糖蛋白等。腺病 毒可以通過呼 吸道或消化道感染，激發宿主局部免疫反應。 其基因組DNA相對較小， 含有2個複製非必 需區, 便於操作。如以人腺病毒5型狂犬病病毒糖蛋白重組載體免疫小鼠和犬，可以誘導 較高水平的抗體，並可保護小鼠抵抗致死性攻擊。 異源性無致病性的火雞皰疹病毒載體亦已構 建成功。在HVT載體中表達的外源性目的基因有新城疫病毒F基因， 馬立克氏病毒gB基因等。此外，利用弱毒株豬偽狂犬病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒構建 活載體疫苗的研究，也取得了明顯進展。以RNA病毒為 活載體的研究近年來也有一些令人鼓舞的報道。如小RNA病毒科中的脊髓灰質炎病毒(PV)Sab in疫 苗株在實際應用中證明安全、穩定、可口服，並且易增殖，感染滴度高。研究發現，PV中的 結構蛋白P1區在基因組複製時是非必需的，缺失P1區的亞基因組雖可複製，但不能包裝成病 毒 粒子，在提供P1殼粒之後，亞基因組可以被包裝起來，形成病毒粒子。因此可以將P1區中的 部 分氨基酸缺失掉，代之於外源性病毒保護性抗原決定簇，形成嵌合病毒粒子，以PV為載體 研 究的嵌合病毒包括PVⅠⅡ型、PVⅠⅢ型間嵌合體病毒、 PV人免疫缺陷病毒(跨膜 糖蛋白 gp41中和抗原表位)、PV人乳頭瘤病毒16(L1蛋白16氨基酸肽段抗原表位)嵌合體病毒。在 獸疫病毒中以口蹄疫病 毒的保護性抗原決定簇核酸片段構建的PVFMDV嵌合體病毒, 能使豚鼠抵禦侵染。 脊髓灰 質炎病毒作為載體與前麵所述的病毒活載體有所不同，前述載體係將外源性保護性抗原分泌 到 載體病毒粒子以外，而脊髓灰質炎病毒載體表達的外源性病毒蛋白則以嵌合的形式存在於載 體病毒 顆粒的表麵。二者均可以構建成多價載體疫苗。但是小RNA病毒基因組容量較小，插 入的外源基 因片段大小有限; 插入不當會造成致死性突變; 形成的嵌合體病毒增殖較慢; 外源性病毒抗 原的免 疫原性較弱等。因此小RNA病毒作為載體的研究尚有待於進一步深入改進和完善。以負鏈RNA病毒， 如流感病毒， 作為載體的研究亦已嚐試多年，並取得重大進展。流感病 毒 RNA沒有感染性，不能自行複製。為了使重組的RNA能夠複製並具有感染性，Luytjes等建立 了流感病毒核糖核蛋白體(RNP)的重組及轉染係統，即用提純的病毒RNA聚合酶和核蛋白與 體外重組的病毒RNA組建具有轉染活性的RNP，然後將RNP轉染進已被輔助病毒感染的細胞。E nami等構建的重組流感病毒RNA表達質粒中，流感病毒的非結構蛋白基因被外源基因的反 義序列取代，當質粒轉錄後，重組病毒RNA與核蛋白和RNA聚合酶重建成為RNP，在流感病毒 依賴RNA的RNA聚合酶作用下，外源基因的反義序列即被轉錄成為正義鏈，並隨病毒的複製 而表達。嚴家新等將人免疫缺陷病毒(HIV) MN株gp120抗原上V3環中的12肽核酸序列，插入 流感病毒A/WSN/33株血凝素B抗原位點的突出環狀結構上，構建成嵌合體病毒。表達V3環中1 2肽的嵌合體病毒能夠誘導小鼠產生HIV特異性抗體。由於流感病毒可以同時誘導體液免疫 和細胞免疫，並能產生IgA介導的粘膜免疫，因此，有希望成為新型的高效活疫苗。(4)遺傳重配疫苗： 適用於分節段基因組的病毒，如正粘病毒和輪狀病毒等。其原理是 將具有特殊保護性抗原的強毒野毒株與弱毒株共感染雞胚或培養細胞，通過兩毒株間的自然 生理重配, 獲得 重配減毒活疫苗。目前流感病毒的冷適應重配疫苗和鴨人毒株重配疫苗在人的臨床試驗 中，已經取得有希望的結果。在動物, 用人流感病毒熱敏株和馬流感病毒野毒株進行遺傳重 配, 也獲得了減毒的重配馬流感病毒疫苗, 由於該重配疫苗能夠表達馬流感病毒的血凝素 和 神經氨酸酶, 因而接種後能夠使幼駒獲得免疫保護。禽流感以及藍舌病病毒的遺傳重配疫苗 研究也取得了一定進展。 另外，利用不同屬小RNA病毒(口蹄疫病毒和腸道病毒)也實現了體內重配 ，並得到了重配 病毒株。
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