組織細胞在體外增殖的條件較細菌等微生物嚴格得多,尤其是培養液要接近體內條件,才能使細胞發育增殖。首先要著重指出的是,各種細胞培養用的溶液都是由水配製的,因此水的質量至關重要。要應用一般二餾水再經玻璃蒸餾器蒸餾一次的三餾水。也可將二餾水通過離子樹脂柱處理一次,獲得電阻150萬歐姆以上的去離子水,主要用於配製洗液。所用的化學藥品至少是分析純試劑或生物學試劑。
1.Hanks液〖HT〗用於衝洗動物組織和細胞以及配製胰酶等分散劑和營養液等,具有等滲和一定的酸堿緩衝能力。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗160g〖〗KCl〖〗8g〖〗MgSO4•7H2O〖〗2g〖〗MgCl2•6H2O〖〗2g〖〗加水〖〗至800ml〖〗〖〗〖〗CaCl2〖〗28g〖〗加水〖〗至100ml〖WX)〗將上述兩種溶液混合後,加水至1000ml,並加2ml氯仿作為防腐劑,保存於0～4℃冰箱內。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗Na2HPO4•12H2O〖〗304g〖〗KH2PO4〖〗120g〖〗葡萄糖〖〗2000g〖WX)〗溶於800ml水中,最後加入100ml04%酚紅液〖ZW(〗04%酚紅液:稱取酚紅,置研缽中逐漸滴入01mol/LNaOH,不斷研磨至顆粒完全溶解,01mol/LNaOH的總加入量為1128ml,再加入去離子水至所需量,即為04%酚紅溶液。〖ZW)〗。加水至1000ml,加2ml氯仿防腐,保存於0～4℃冰箱內。按下述比例配成Hanks液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗1份〖〗原液乙〖〗1份〖〗水〖〗18份〖WX)〗10磅15分鍾滅菌後,置0～4℃冰箱內備用。使用時於100mlHanks液內加入35%NaHCO3液,將pH調至72～76。
2.Earle氏液〖HT〗成分與Hanks液相近,但緩衝作用更強些。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗680g〖〗KCl〖〗40g〖〗NaH2PO4•H2O〖〗14g〖〗葡萄糖〖〗100g〖WX)〗將以上各成分溶解於水中,最後加水至500ml。加氯仿1ml防腐,置0～4℃冰箱內備用。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗20g〖〗MgCl2•6H2O〖〗17g〖〗04%酚紅液〖〗50ml〖WX)〗將以上各成分溶解於水中,最後加水至500ml,加氯仿1ml防腐,置0～4℃冰箱內備用。按下述比例配成Earle氏液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗1份〖〗原液乙〖〗1份〖〗水〖〗18份〖WX)〗10磅15分鍾滅菌後,置0～4℃冰箱內備用。使用時加入NaHCO3液,如上調整pH。Hanks液和Earle氏液是組織培養中最常用的洗液,也是配製營養液的基礎液。
3.磷酸緩衝鹽水(PBS)〖HT〗由於Hanks液和Earle氏液的pH值都是用二氧化碳-重碳酸鹽緩衝係統維持的,故在配製長時間接觸空氣的液體時,例如病毒稀釋液以及組織抽提液等,應該使用PBS。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗800g〖〗KCl〖〗020g〖〗Na2HPO4〖〗115g〖〗KH2PO4〖〗020g〖〗04%酚紅液〖〗5ml〖WX)〗溶於500ml水中,加入5ml04%酚紅液,加水至800ml。10磅15分鍾滅菌備用。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗MgCl2•6H2O〖〗01g〖WX)〗溶於100ml水中,10磅15分鍾滅菌備用。(3)原液丙〖WX(!10KG5,7YQ〗CaCl2〖〗01g〖WX)〗溶於100ml水中,10磅15分鍾滅菌備用。按下述比例配成工作液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗8份〖〗原液乙〖〗1份〖〗原液丙〖〗1份〖WX)〗配製胰酶時需用無鈣的PBS,可用水代替原液丙。
4.抗生素溶液〖HT〗抗生素雖不提供營養,但能防止細菌和黴菌汙染,它的應用,促進了組織培養的發展,是細胞營養液中不可少的成分。(1)防止細菌汙染:通常將青黴素和鏈黴素配製成混合試劑,簡稱“雙抗”,效果比單用好。配製時將100萬單位青黴素G和100萬單位鏈黴素溶解於滅菌的100ml三餾水(或平衡鹽溶液)中,使每ml含青黴素1萬單位和鏈黴素1萬單位。為防止支原體汙染,常在雙抗中加入卡那黴素,這樣即稱“三抗”,其配製濃度與鏈黴素相同。將配製好的聯合抗生素溶液分裝小瓶後,置-20℃以下低溫冰箱保存備用。使用時,每100ml洗液或營養液中加入上述抗生素液1ml,則每ml使用液中抗生素的濃度分別為100單位。在容易發生汙染的炎熱潮濕季節,可加大使用濃度1倍。(2)防止黴菌汙染:兩性黴素具有強烈的抑製黴菌作用。配製時取靜脈注射用兩性黴素B(50mg),溶於250ml滅菌水中,配成每ml含200μg的溶液,分裝小瓶,置-20℃低溫下保存備用。使用時,於100ml營養液內加入上述兩性黴素溶液05～1ml,使其最終濃度為1～2μg/ml。近年國外使用一種叫Fungizone的抗黴菌素,用Hanks液配製成每ml含量為100μg的溶液,分裝小瓶後,置-20℃以下低溫冰箱保存備用。使用時,於每100ml營養液中加入上述溶液1～5ml。(3)抗生素的用法和保存:常規的細胞培養物,一般隻加雙抗,隻當存在黴菌或支原體汙染的較大危險時,才再加入相應的其它抗生素,例如在潮濕多雨季節,可以考慮加1～2μg/ml的兩性黴素等。已經汙染的細胞培養物,照例全部廢棄。隻在特殊情況,例如新培育的或者特需的某一細胞株發生汙染時,才考慮應用高濃度抗生素處理的辦法。例如應用加有比正常量大5～10倍的兩性黴素、金黴素、卡那黴素或慶大黴素等的營養液,給汙染細胞培養物換液,每天一次,連續3～4次。此後改用正常含量抗生素的營養液進行傳代,連傳4代,如果沒有汙染現象出現,即可假定地認為這個細胞培養物的汙染已經消除。由於高濃度的抗生素會對細胞培養物呈現毒性作用,而各種抗生素抑製不同微生物種類的作用又不一樣,因此,應在進行上述高濃度抗生素處理之前,先作各種抗生素對汙染微生物的抑製試驗以及該細胞培養物對相應濃度抗生素的耐受性試驗,以便找出最合適的抗生素及其應用濃度。在-20℃低溫保存的上述各種抗生素溶液,可以使用3個月。
5.碳酸氫鈉溶液〖HT〗此液與氣相CO2一起,可對各種洗液或營養液提供緩衝係統,碳酸氫鈉同時也是一種重要的代謝物。通常配成56%、75%或88%濃度的溶液,10磅高壓滅菌15分鍾(為防止膠塞在高壓滅菌時崩掉,可先用紗布和麻繩將其紮緊),分裝小瓶,並用橡皮塞蓋緊,保存於4℃冰箱內備用。配好的碳酸氫鈉溶液也可應用玻璃濾器除菌。
6.細胞分散劑〖HT〗是能使組織塊或成片細胞分散成單個細胞的化學製劑或生物製劑。胰酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和灰色鏈絲菌酶是當前最主要的細胞分散劑。(1)胰酶:胰酶使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發生水解,導致細胞間質水解而使組織塊或單層細胞“消化”為分散的單個細胞。但如作用時間太長,也可使細胞發生嚴重損傷。配製時通常是取粉狀胰酶(1:250)25g,溶於pH74～76的無鈣PBS中,作成025%溶液,用玻璃除菌濾器或除菌濾膜過濾後,分裝小瓶,保存於-20℃低溫冰箱內備用。作者實驗室的方法是用普通Hanks液將胰酶配成1%的濃度,除菌過濾後,-20℃凍結保存。使用時再以Hanks液稀釋成025%的濃度,並將pH調整到74～76。由於動物血清中含有抗胰酶物質,可使胰酶喪失蛋白分解作用,故在應用胰酶“消化”組織塊或單層細胞時,應先充分衝洗,除去組織塊或單層細胞中殘留的血液或血清成份。為了防止汙染,可在胰酶溶液中加入抗生素,使每ml胰酶溶液分別含有100單位青黴素、100單位鏈黴素、1μg兩性黴素B以及10μg金黴素、慶大黴素或卡那黴素。(2)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA):某些組織,特別是上皮組織,需要有鈣、鎂兩價離子的存在,才能保持其完整性。如果應用某種物質或方法除去這些離子,就可使組織細胞分散脫離。EDTA就因結合組織中的這些離子,使組織細胞分散而被用作細胞分散劑。也是由於這個緣故,配製EDTA溶液必須無鈣無鎂,且在應用EDTA“消化”細胞後,應該將其傾棄,以免影響細胞生長。EDTA主要用於上皮細胞類繼代細胞株或傳代細胞係的傳代。也曾用於腎髒等組織的“消化”,但其效果似乎不如胰酶。有人建議應用胰酶和EDTA的混合液“消化”腎髒組織,據認為可獲得極高的細胞產量。應用這種混合液“消化”上皮細胞類繼代細胞株或傳代細胞係,效果很好,已被某些實驗室作為通用方法。EDTA的使用液為其002%溶液,配製方法如下:〖WX(!10KG5,7YQ〗EDTA〖〗005g〖〗NaCl〖〗200g〖〗KCl〖〗005g〖〗Na2HPO4〖〗029g〖〗KH2PO4〖〗005g〖〗細胞培養用三餾水〖〗250ml〖WX)〗濾紙過濾,分裝小瓶,10磅10分鍾高壓滅菌後,保存於0～4℃備用。(3)灰色鏈絲菌酶(Pronase):是由灰色鏈絲菌提取的一種酶製劑,是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。某些實驗室應用灰色鏈絲菌酶“消化”雞胚和鼠胚組織,並用於許多上皮細胞類和纖維樣細胞類單層細胞的傳代,據認為“消化”作用比胰酶強,而且消化下來的細胞更為分散和均勻。但對某些傳代細胞係,例如HeLa細胞和KB細胞等,應用灰色鏈絲菌酶“消化”後,卻常出現小片狀細胞塊,說明“消化”不完全。某些學者認為灰色鏈絲菌黴最適於某些成纖維細胞二倍體株的分散,應用005～01%濃度的灰色鏈絲菌酶甚至可在幾秒鍾內使細胞從瓶壁上脫落和分散。但是必須指出,由於動物血清中沒有此酶的天然抑製物,故將細胞分散以後,必須應用等滲鹽溶液充分衝洗,並用低速離心沉澱方法除去殘留的灰色鏈絲菌酶,以免其繼續損害細胞。配製灰色鏈絲菌酶使用液時,可取025g灰色鏈絲菌酶,溶於500mlPBS中,混合並在室溫放置半小時後,低速離心沉澱10分鍾,除去其中未溶的顆粒,並經玻璃濾器或濾膜過濾除菌,分裝小瓶,-20℃低溫保存備用。也可稱取1g灰色鏈絲菌酶,與少量PBS液混合調成糊狀,再行逐漸添加PBS液,並不斷攪拌,直至最後達100ml,並呈均勻的乳狀液。置4℃冰箱內幾個小時,低速離心沉澱,除去顆粒,並用濾器過濾除菌後分裝小瓶,置-20℃保存,可用幾個月。使用時,待其融化後用平衡鹽溶液進一步稀釋為005%或01%的溶液。上述胰酶、EDTA和灰色鏈絲菌酶等三種分散劑,其特性和作用原理不同,使用上也各有優缺點。因此,各個實驗室必須根據自己的經驗和條件,選用最適於各該細胞的分散劑。現在常用胰酶和EDTA混合液作為細胞分散劑,據認為“消化”效果優於單獨一種分散劑。作者等試用於多種繼代細胞株和傳代細胞係,效果也較好,但似乎更適用於上皮樣細胞類的消化、分散。配製時一般先按下方配成10倍濃縮液,使用時臨時以雙餾水作10倍稀釋後應用。〖WX(!10KG5,7YQ〗胰酶〖〗25g〖〗NaCl〖〗400g〖〗KCl〖〗20g〖〗葡萄糖〖〗50g〖〗NaHCO3〖〗29g〖〗EDTA〖〗10g〖WX)〗以上依次溶於450ml三餾水中。為使胰酶充分溶解,可置37℃水浴加溫,務使液體完全清亮。隨後加入1%酚紅1ml(也可不加),再加10萬單位雙抗溶液5ml(也可不加)。加足三餾水至500ml,以G-6玻璃濾器或相應的濾膜濾過除菌,分裝後置-20℃保存。臨用時用三餾水稀釋。
7.穀氨酰胺〖HT〗配製成3%溶液,即稱3g穀氨酰胺溶解於100ml三餾水中,振蕩促溶,用玻璃濾器或濾膜過濾除菌,分裝小瓶後置-20℃以下冰箱內保存備用。此溶液在冰凍保存時析出白色沉澱物,融化混合後即可溶解。使用時在每100mlE-MEM或其它不含穀氨酰胺的營養液中加入此液1ml。
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