營養液是組織培養係統中細胞賴以生長和增殖的直接環境,因此不僅要求供給各種營養物質,例如氨基酸、糖類、維生素和無機鹽類等,而且必須保證適宜的溫度、酸堿度、滲透壓和氣相。目前所用的各種營養液是根據細胞的營養要求和生長特性而精密設計和配製的所謂人工綜合營養液,在培養時添加血清或某些細胞生長因子即可滿足細胞的生長繁殖。營養液在細胞培養過程中可分為生長液和維持液。前者是在細胞培養初期使細胞發育增殖的液體,因此要求營養條件豐厚;後者是在細胞基本發育增殖後加入的維持性營養液,它與生長液的主要差異是血清含量減少或不含血清。維持液可使細胞代謝趨緩,從而延長細胞的活存時間,以利於實驗的進行。
1.血清〖HT〗動物血清中具有細胞生長所必須的各種營養因子,它能促進細胞的貼壁和生長,且有很強的酸堿緩衝能力。許多實驗室直接利用血清(或以血清為主要成分)成功地培養了許多細胞種類。作者等應用犢牛血清培養馬屬動物以及豬、狗等動物外周血液中的白細胞(大單核細胞),取得很好效果。試用全血清培養驢胎繼代細胞、豬腎傳代細胞、人腎傳代細胞以及小白鼠胚細胞、雞胚細胞和倉鼠腎細胞等原代細胞也能獲得較好的生長,但迅速衰老。當前,動物血清通常用作營養添加物,亦即用其豐富或補充其他營養成分,使營養液具有更完全的營養成分。僅在培養外周血液白細胞或骨髓細胞時,有時應用全血清。一般認為動物血清中具有細胞生長因子或稱生長剌激因子,有明顯的促細胞生長作用。故在培養各種細胞時一般都要求加入適量(例如5～10%)的血清,但維持液可減少血清用量,甚至全部不用血清。各種動物的血清都能應用,而且並不要求同種血清,例如胎牛血清或新生犢牛血清可以用於人、馬、豬、狗、鼠等多種細胞的培養。但也有人強調應用同種血清,如在培養人類細胞時應用或添加少量的人血清等等,據認為有利於細胞貼壁。由於同一種動物的不同個體的血清,在組成成分上可能有差別,因此最好應用采自幾個個體的混合血清。混合血清的數量較大,進行一次鑒定試驗,可以長期使用。某些血清可能對細胞呈現毒性作用,這種毒性作用似與血清所含的脂蛋白,特別是膽固醇和三磷酸甘油酯有關。應用滅菌玻璃粉處理新鮮血清,或者應用石棉或玻璃濾器過濾,因其吸附脂蛋白,常能降低血清對細胞的毒性作用。但須注意,石棉濾板中可能含有毒性物質,故在應用石棉濾器過濾時,應將最初濾出的部分血清廢棄。血清中還可能存在一些能遮蓋細胞膜上病毒受體的物質,從而降低和影響病毒對細胞的感染。作者等應用細胞吸附法處理血清,成功地提高了某些病毒的陽性分離率。具體方法是:首先培養病毒分離時將要應用的那類細胞,待其長成細胞單層時傾棄營養液並用等滲液衝洗2遍,甩幹後在細胞單層上加入56℃滅活的血清,厚度不超過2mm。先置37℃感作2小時,再放4℃冰箱4小時或過夜。隨後吸出上層血清,低速離心後備用。每個批次的血清,都應在使用前對相應細胞作培養試驗。多數實驗室應用新生犢牛血清,因其較易大量采集,且有很好的細胞培養效果。近年市場上已能購到犢牛血清。根據各實驗室的具體條件和需要,也可應用馬血清、大牛血清、綿羊血清或雞、兔血清等等,但是必須經過試驗,而且效果多不如犢牛血清,當然胎牛血清最好。(1)犢牛血清:犢牛出生後,不給吮乳,盡早由頸動脈無菌放血。可用3000～5000ml的三角燒瓶作采血瓶。采血前先向瓶內加入30～50ml等滲鹽溶液,濕潤瓶壁,以免采血後血凝塊粘附瓶壁,影響血凝塊收縮。采血後置37℃溫箱或水浴中1小時,隨後再置室溫或4℃冰箱內1天,傾出血清(其中混有較多紅細胞),分裝於大離心瓶中,以3000r/min的速度離心沉澱半小時,吸取上層透明的血清,並視需要分裝於50～100ml滅菌瓶中,置-20℃以下低溫冰箱中保存備用。使用前置56℃水浴中加溫滅活30分鍾,並作無菌、毒性和細胞培養試驗。如無大型離心機,也可將血液采入幾個較小的瓶內,每瓶采血量不超過瓶容量的1/2。將瓶斜放,置37℃1小時,再放4℃24小時,即可吸取上層透明血清。僅其下層混有紅細胞的血清需要離心沉澱處理。從每頭公犢牛約可獲得1000～1500ml血清。這種犢牛血清與胎牛血清相近,培養細胞的效果很好,但對於某些病毒,例如細小病毒、冠狀病毒和副粘病毒等的培養,犢牛血清具有比較明顯的病毒抑製作用,故在分離和培養這類病毒,特別是由病料初代或前幾代分離和培養這類病毒時,最好應用5月齡以內的胎牛血清。胎牛血清通常由剖腹取胎後獲得。(2)牛、馬、羊血清:通常由頸靜脈采取,或屠宰時由頸動脈放血采取。采血前必須禁食1天,以免血清因混有乳糜而混濁。應用成年動物血清培養細胞,效果不如犢牛血清。由於自然感染或疫苗接種,成年動物血清中還常含有抗病毒抗體。其所含有的病毒抑製物質,也常比犢牛或胎齡動物血清中的含量高,因此,在供病毒培養用的細胞營養液內,必須避免應用可能含有這些抗病毒因子的血清,如在培養乙型腦炎病毒的細胞培養液內,當然不能添加含有乙型腦炎抗體的血清。(3)其他血清:如兔血清和雞血清等,由於產量太小,一般隻在特殊需要,例如對特定細胞的培養時才應用。
2.血漿〖HT〗是早期組織培養工作中培養組織塊時常用的營養液和固體支持劑。現在很少使用。
3.組織浸出液〖HT〗也是早期組織培養用的營養成份,多用9～11日齡雞胚製造。添加血清的人工綜合營養液完全可以代替組織浸出液,因此目前不常應用。
4.05%乳白蛋白水解物〖HT〗乳白蛋白水解物是乳白蛋白、乳球蛋白和血清蛋白的水解產物,含有大量多種氨基酸和肽類,比E〖DK〗MEM所含的種類還多。應用Hanks液或Earle氏液配製的05%乳白蛋白水解物,特別是在添加犢牛血清後,可以培養哺乳動物絕大多數的組織細胞,例如腎、肺、皮膚、皮下結締組織、肌肉和雞胚細胞等。由於它廉價,主要用於對營養要求不十分嚴格的細胞培養。配製時,稱取乳白蛋白水解物5g,溶解於1000mlHanks液或Earle氏液中,待其完全溶解,按需要量分裝於玻璃瓶中,10磅高壓滅菌20分鍾,冷卻後保存於4℃冰箱內備用。使用前調整pH,並添加抗生素和血清等其他成分。
5.人工綜合營養液〖HT〗此類營養液是根據細胞的營養要求,逐項配合各種化學物質,並按照實驗結果加以改進完善。人工綜合營養液的主要成分有氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶和輔助生長因子等。天然營養液的成分複雜,而且常因動物種類、個體和製備方法的不同而有質量上的差異,有時甚至含有抑製細胞生長或病毒增殖的物質。人工綜合營養液則不同,由於它是由已知成分配製的,所以質量穩定。目前已研製成功無血清培養液,即培養時不加動物血清,也能夠保證細胞的正常生長繁殖。因此適於應用細胞培養製備或生產單克隆抗體及各種基因工程表達的生物活性多肽因子,也可用作精細的生化學定量分析,研究細胞的生長和代謝規律。近年來設計的人工綜合營養液配方多達幾十種,但最常應用的是Eagle氏最低要素營養液(簡稱E〖DK〗MEM)、RPMI1640、199和L15等。雖然不同的營養液各有特點,但實際上均可用於多種細胞的培養。所有人工綜合營養液至少含有13種氨基酸,即精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、穀氨酸和穀氨酰胺。E〖DK〗MEM就隻含有這13種氨基酸,維生素種類也比較少,但對多種細胞都能培養。199含有的氨基酸種類多達21種,維生素的種類也很多,主要用於營養條件要求苛刻的細胞。RPMI1640和L15的營養成分介於E〖DK〗MEM和199之間。最近一些廠家又推出很多新產品,如美國生命技術公司的“幹粉無需CO2培養基”、“DMEM新配方幹粉培養基”、“RPMI1640新幹粉配方培養基”和“肝細胞培養基”等多種人工綜合營養液。現在我國也有多種國產營養液、濃縮原液及合成粉劑出售,使用時隻須按說明書要求,以三餾水溶解或稀釋,用濾器過濾除菌(濃縮原液用滅菌三餾水稀釋後即可使用)後即可使用。E〖DK〗MEM因不含穀氨酰胺(配製營養液時現加),故可用8磅15分鍾滅菌。在使用人工綜合營養液配製細胞生長液時,視細胞要求加入適量血清,通常為4%～20%;維持液血清量較少,一般為1%～3%,有的可不加血清,再加入規定量的抗生素溶液,最後滴加56%碳酸氫鈉溶液修正pH為72～74即可使用。因E〖DK〗MEM幹粉製劑不含穀氨酰胺,配製時要向每100ml營養液中,加入3%穀氨酰胺溶液1ml,然後再修正pH。
6.無血清人工綜合營養液〖HT〗為了排除血清對實驗的幹擾,從50年代開始,人們開始研製不含血清的細胞培養液。通過多年實驗研究,已發現可以代替血清的營養成分:①某些激素和生長因子,如胰島素、生長激素、前列腺素和表皮生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等20餘種;②結合蛋白類,如轉鐵蛋白(TF)和無脂肪酸白蛋白等;③貼壁和鋪展因子,如冷不溶球蛋白、血清鋪展因子和胎球蛋白等;④某些低分子量營養因子。其中最多用的是胰島素、轉鐵蛋白和硒鹽。配製時,根據培養細胞的種類,添加營養成分。作為無血清培養液的基礎,最多用的是F12和DME的1∶1混合液,其次是RPMI1640和199等。近年一些外國廠家推出了多種適宜於不同細胞培養的無血清培養基,有幹粉和濃縮液兩種產品,如“內皮細胞無血清培養基”、“造血幹細胞無血清培養基”、“人內皮細胞無血清培養基”、“雜交瘤無血清培養基”和“巨噬細胞無血清培養基”等。不言而喻,這些商業性產品的出現,為無血清營養液的推廣應用創造了方便條件。
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