在將原代細胞繼續傳代的過程中,往往可以發現原來占優勢的一些細胞逐漸減少乃至消失,而另一些細胞卻可能後來居上,取而代之。例如原代腎細胞培養物中主要是上皮樣細胞,纖維樣細胞較少或很少。但在繼代培養過程中,後者逐漸增多,3～4代或更多一些代次以後,上皮樣細胞明顯減少以至消失,而大部或全部成為了纖維樣細胞。其他組織的培養物,例如肺和骨髓等,也都存在這種情況。應用異種血清,例如繼代培養豬腎細胞或倉鼠肺細胞時應用犢牛血清,最易出現這類現象。這是因為動物器官和組織中經常含有許多種類的細胞,在原代腎培養物中,腎上皮細胞最多,故在顯微鏡下觀察,以上皮樣細胞為主。但將原代培養物作繼代培養時,由於纖維樣結締組織細胞的生長比上皮細胞快得多,逐漸改變兩者的數量關係,最後成了纖維樣細胞的一統天下。應用同種血清,例如以犢牛血清培育牛腎細胞,以豬血清培育豬腎細胞,較易保持其上皮細胞類型。但是,更好的辦法是采取純化技術,選取並育成所需細胞類型,例如上皮細胞的細胞株。再者,即使已經純化的細胞株,在長期的傳代過程中,也可能因發生變異而使細胞株在形態、生理特性和對病毒的敏感性方麵呈現不一致現象。這也要求我們采用純化篩選手段,以便保證細胞株的均一和穩定。所謂細胞克隆技術,就是從一般細胞株(係)的培養物中,獲得由一個單細胞後代增殖的細胞群體。所獲得的這種生物學性狀一致的細胞培養物稱為克隆化細胞株,從而達到細胞純化篩選的目的。應用這種純化細胞株進行的實驗不僅科學可靠,而且能提高細胞的敏感度和可重複性。如流行性出血熱病毒的分離培養曾是醫學病毒實驗室的一個難題,但在應用細胞克隆技術,從Vero細胞中獲得了對病毒敏感的Vero〖DK〗E6純化細胞係後,一舉分離成功,難題迎刃而解。如前述,日常應用的細胞株(係)都是經過長期多次傳代的,由於傳代過程中各種條件的變化,以及細胞本身的生物變異現象,不斷產生細胞分化,結果成為在生物性狀上不盡一致的細胞群體。可見應用細胞克隆技術,解決細胞的純化問題就顯得十分必要。各種細胞株的單胞增殖率明顯不同。所謂“單胞增殖率”,是指將一定數量的分散細胞接種入培養瓶或平皿內,待其生長增殖,計算已經形成的細胞集落數目,其占有原來種入的細胞數的百分比,就是單胞增殖率或稱集落形成率。傳代細胞,例如HeLa細胞的單胞增殖率很高,可達10%～20％,因此易在單細胞分離培養中獲得純係細胞。原代細胞和繼代細胞的單胞增殖率較低,通常在2%～3％以下,甚至不到1％,單細胞分離培養的成功率也相應降低。細胞種類當然也是決定單胞增殖率的一個重要因素,例如腫瘤細胞的單胞增殖率顯著高於正常細胞,結締組織細胞和上皮細胞又比其它細胞易於形成純係細胞等等。現將單細胞分離培養技術中幾種比較常用的方法介紹如下:
1.毛細管法〖HT〗是將單個細胞培養於極微量的營養液內,使其能夠改變周圍營養液,使營養液“條件化”,以適應細胞的生長和增殖。通常應用199人工綜合營養液和E〖DK〗MEM液等,內加20％的犢牛血清。為使這種營養液能夠更好地適應單個細胞的生長和增殖,可以預先加以“條件化”,亦即取新培養而即將長成單層的同類細胞培養物,傾棄原來的營養液,加入新營養液,37℃培養1天後,吸出營養液,以微孔濾膜或以3000r/min的速度離心沉澱30分鍾,除去可能混懸其中的細胞,取上清液裝瓶備用。應用時加入1％的葡萄糖,並將pH調整至70～72。取內徑5～6mm、壁厚05～07mm的優質玻璃管,截成5cm長,置硫酸重鉻酸鉀清洗液內浸泡1天,取出後用自來水和蒸餾水反複衝洗,甩幹後浸泡於三餾水或去離子水中2天,每天換水1～2次。最後再用三餾水或去離子水衝洗後烤幹。於酒精噴燈上將其拉成內徑為005～01mm的微毛細管,並截斷成10mm長的小段。再用三餾水或去離子水浸泡過夜,取出後置光麵濾紙上,放入平皿,幹熱滅菌備用。準備50～100個小培養瓶或優質青黴素瓶,並按培養瓶的形狀逐個加入一塊稍小於培養瓶底的優質玻璃紙。玻璃紙需事先用分析純的乙醚、酒精、丙酮和三餾水分別順序地浸泡15分鍾,隨後用鑷子送入培養瓶內,一起高壓滅菌備用。根據細胞種類,用細胞分散劑將單層細胞消化下來,在上述已經“條件化”了的營養液內充分吹打成均勻分散的細胞懸液,並進一步稀釋為每ml含1000～2000個細胞的細胞懸液,置滅菌小平皿內。迅速用鍾表鑷夾住微毛細管,將其一端浸入細胞懸液內,使細胞懸液自動吸入管內。置滅菌玻片上,上蓋滅菌玻璃紙防塵,用低倍顯微鏡進行檢查。挑選管內確實隻有一個細胞的微毛細管,置入事先加有1～2ml營養液的培養瓶內(含玻璃紙),並用鑷子或白金針將其送於玻璃紙的下麵,並將玻璃紙展平,鋪於瓶底。隨即吸棄培養瓶中的營養液,使玻璃紙粘貼於瓶底,並將微毛細管夾於玻璃紙與培養瓶底之間。逐個操作完了之後,鬆鬆地塞上橡皮塞,並置5～10％CO2環境中於37℃培養2小時,取出後將瓶塞塞緊,繼續培養。根據各該細胞的單胞增殖率,一般需作50～100管,有時甚至更多。兩天後開始觀察,此後每天或每隔一天觀察一次,發現細胞由微毛細管端逸出並在培養瓶底形成細胞群落時,即可加入較大量的營養液,並考慮作傳代培養。〖HT5H〗2.終點稀釋法〖HT〗這種方法較為簡便,即將處於旺盛生長期的單層細胞培養物用胰酶消化下來後,應用前述“條件化”了的營養液作高倍(從10-1到10-7左右)稀釋,然後從10-5開始分別接種微量培養板,每個稀釋度至少接種50個孔。從培養48～72小時後開始,逐日在倒置顯微鏡下觀察,取最高稀釋度有細胞增殖的孔,用胰酶消化並擴增培養後,繼續按上述方法重複克隆,至少兩次以上,即可獲得克隆細胞株(係)。
3.微滴法〖HT〗先在潔淨的60mm直徑平皿底上鋪放10mm直徑或見方的蓋玻片(8～10片),傾入滅菌液體石蠟,使有4～5mm的深度。用滅菌細玻棒將蓋玻片沿皿緣作較規律的排列,各片之間及其與皿緣的距離約10mm。在蓋玻片上方滴加“條件化營養液,使其恰好下沉於蓋玻片上,形成5mm直徑左右的液滴。隨後用毛細管吸取單個細胞(操作方法如前),吹入於石蠟下的液滴中。如此重複操作,約作10～20個培養皿的培養,共計100～200多個細胞和液滴。蓋上平皿蓋,置5～10％CO2環境中,37℃培養。2～3天後開始檢查,此後每天觀察一次,並根據需要適當更換營養液,一般在10天左右長成細胞集落。此時即可吸棄細胞集落上的營養液,加入1滴01％胰酶,消化3～5分鍾,適當吹打,使細胞脫離蓋玻片,吸出細胞懸液,培養於另一小培養瓶中,並追加1～2ml新營養液,待其進一步生長增殖後傳代。
4.飼養細胞層法〖HT〗為提高單細胞的生長增殖率,可以應用飼養層細胞法,即先培養HeLa細胞或豬腎傳代細胞等單胞增殖率高的細胞,待其長成單層,用2000～4000R的X〖DK〗線照射(各該細胞株的X〖DK〗線照射劑量需經預備試驗測定)。經過X〖DK〗線照射的細胞,不再能夠分裂,但還保持其使營養液“條件化”的能力,並因提供“直接接觸”和“代謝合作”而促進單個細胞的生長增殖。於照射後第2天吸棄營養液,胰酶消化,作成每ml含1～2×104個細胞的懸液。於聚苯乙烯微量培養板的小孔內,每孔加入這種已用X〖DK〗線照射的細胞01ml,同時加入1個待克隆的單細胞。加蓋後置CO2環境中,37℃培養,飼養層細胞即全部脫落。而待克隆的單細胞,此時(7～10天)可能已生長增殖,即可進行胰酶消化和傳代培養。
5.軟瓊脂法〖HT〗主要用於惡性變細胞和腫瘤細胞的分離培養和建立細胞株。因為正常動物組織的原代培養細胞和繼代培養細胞,通常不能在液體和半固體呈現懸浮生長,而腫瘤細胞、傳代細胞係以及由致瘤病毒或化學致癌物誘變的惡性變細胞,卻常可在半固體營養瓊脂內形成細胞集落。首先製備05％營養瓊脂,亦即軟瓊脂。取125g優質瓊脂或瓊脂糖,加於800ml去離子水中,煮沸溶化,再加水至1000ml。按每瓶40ml的量分裝,8磅20分鍾高壓滅菌。此為125％瓊脂。應用時將其置水浴中融化,並保持於44℃水浴中。另配取40ml的2倍濃度的營養液(199或E〖DK〗MEM),加入犢牛血清和胰蛋白〖HT5,7SS〗月〖KG-*4〗〖HT5,7SS〗示〖HT〗磷酸鹽液各10ml,混合後置水浴中,也使其達44℃。隨後迅速將其傾入於上述44℃的瓊脂中,充分轉動混合,此即05％營養瓊脂。吸取05％營養瓊脂10ml鋪加於60mm直徑的平皿內,室溫放置凝固,作為底層瓊脂。另如前述方法製備細胞懸液,使每ml懸液中約含103～104個細胞,置37℃保溫。迅速取此細胞懸液1份,加入於2份44℃營養瓊脂內,充分混合後,吸取2ml覆蓋於底層瓊脂上。置5%～10％CO2環境中,37℃培養。每天在25～50倍的低倍顯微鏡下觀察。約7～10天後開始形成01～02mm直徑的細胞集落。如果培養時間超過10天,可在營養瓊脂表麵滴加2ml營養液,以免瓊脂表麵幹燥。如有較大的細胞集落出現,即可應用毛細吸管將整個細胞集落連同瓊脂一起吸出,移植於另一小培養瓶中的1ml營養液中,稍行吹打,將瓊脂打碎,並用白金針將其挑出。將小培養瓶作靜置培養,使細胞貼壁並生長成單層。
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