實驗室內培養的細胞株,需要定期傳代,這是一項繁重的工作。而且,由於傳代次數增多,相應地增加了細胞汙染和變異(包括惡性變)的危險性。二倍體細胞的建立,更要求減少傳代次數,以免發生過早的衰老死亡。因此,細胞株的保存是組織培養中一個十分重要的工作。這一問題現已基本獲得解決,特別是細胞低溫保存方法的成功,極大地保證和促進了細胞培養工作的發展。
1.細胞培養物的常溫短期保存〖HT〗細胞株和傳代細胞係的短期保存並不困難。將已長成單層的細胞於換液後置室溫或20～22℃溫度下避光保存,一般均可保持細胞的生活力達半個月以上(某些細胞,如BHK〖DK〗21細胞,最多能保存7天左右)。但維持液中的血清含量應提高至5%～10％。與動物組織塊的保存方法不同,細胞培養物不宜在4℃保存。單層細胞在這種溫度下易於發生退化現象,並且較快由培養瓶壁脫落;繼續傳代培養時,細胞活力也明顯降低。如果傳代培養時將培養溫度由37℃降至32℃甚至30℃,則細胞生長緩慢,老化也遲,可以每隔15～30天傳代一次。作者等試用30～32℃的溫度培養HeLa細胞、人羊膜傳代細胞、豬腎細胞(PK〖DK〗15和IBRS〖DK〗2)和驢胎繼代細胞等,20～30天傳代一次,細胞的形態和活力未見明顯變化。如果細胞在這種溫度下生長太慢,不能長成單層,可先將其置37℃培養,待其生長增殖而將形成單層時,再行移置於30～32℃培養。但必須指出,由於缺乏詳盡的細胞學和病毒學上的鑒定數據,上述的細胞保存方法隻是一種可被偶然采用的權宜之計,不能作為細胞保存的基準方法。在需長途運送細胞培養物,例如經火車或飛機送往遠處時,可選擇剛剛長成單層的細胞培養物,棄去營養液,加入維持液至滿瓶,勿使培養瓶內存留空氣。隨後用橡皮塞緊塞瓶口,並作適當的包紮。運輸途中的溫度應保持在15～25℃左右。到達目的地後,將培養瓶內的維持液倒出,僅存留正常的維持液量,並置37℃溫箱中培養1～2天,即可進行傳代培養。如係炎熱夏天,氣溫太高,而運輸路途又遠,則可取不漏水的塑料袋1個,放入若幹冰塊,紮緊袋口,並置入廣口保溫瓶內,同時放入已用紗布適當包紮的細胞培養瓶,使保溫瓶內的溫度保持在10～30℃之間。
2.細胞培養物的低溫長期保存〖HT〗早在40年代,人們就已證明人類精子對-79℃乃至-196℃的低溫具有一定的抵抗力。隨後又發現,甘油對低溫保存的動物細胞具有良好的保護作用:細胞懸液中加入甘油,可以明顯地提高其在-79℃的活存率。60年代以來,另一種化學試劑——二甲基亞碸(DMSO)又被用作細胞低溫保存的保護劑。應用甘油或DMSO已經成功地保存各種組織細胞,特別是在使用-196℃的液氮以來,已經可以幾年或更長時間地保存細胞。實驗證明,當細胞懸液的溫度較快下降到0℃以下時,細胞內開始形成冰結晶,這種冰結晶是使細胞產生機械性損傷的主要原因。溫度繼續下降,細胞外相的冰結晶增多,殘留液中的鹽類濃度增高,水分從細胞內抽出,其結果,細胞內的可溶性物質特別是電解質在殘餘的少量水中逐漸濃縮,又使細胞發生滲透性休克。因此,細胞在被冷凍至0℃以下時,將先後或同時發生冰結晶形成、脫水和可溶性物質濃縮等三種變化。而在快速冰凍時,細胞膜又易發生損傷。但如果溫度下降緩慢,例如每分鍾下降1℃,則發生另外一種情況:細胞內並不出現冰結晶,冰結晶主要形成於細胞外,細胞本身隻發生逐漸的脫水,並不遭受嚴重損傷。因此,“緩慢冰凍”是保護細胞,使之不致發生嚴重損傷的關鍵因素。由於細胞內冰結晶的形成和電解質的濃縮主要發生在-5℃和-10℃之間,因此隻要嚴格控製0℃～-20℃範圍內的溫度下降速度,即可明顯減輕細胞在低溫冰凍過程中的損傷程度。甘油和DMSO是非電解性物質,具有較強的親水性,而且易於穿透細胞膜,可以減輕冰結晶對細胞的機械性損傷作用;此外借助其彌散作用,又可置換細胞內的水分,避免因細胞內脫水而發生電解質濃縮,且使細胞不致發生縐縮。相反,已在低溫冰凍保存的細胞,融解時卻又必須十分迅速,否則也會產生嚴重的細胞損傷。因在緩慢融解時,當細胞由最低溫度(例如-196℃)逐漸上升至-20℃～-5℃時細胞內也會形成冰結晶和發生電解質濃縮。因此,一般是將低溫保存的細胞安瓿直接置入37℃～40℃的溫水中,使其盡快融解,以減少細胞損傷。總結細胞低溫保存的經驗,可以歸納為一句話,那就是:“緩慢的冰凍和迅速的融解”。至於什麽樣的低溫條件最有利於細胞保存?何種溫度是其可以允許的上界?則還沒有充分的研究。一般認為,保存溫度最好低於-130℃,因在-130℃以下的低溫下,細胞的生命活動降至最低點,有利於長期保存細胞。液氮是目前廣泛應用的冰凍劑。(1)細胞懸液的製備:將已長成或即將長成單層的生長旺盛的細胞,例如培養2～3天又經換液1～2天的單層細胞,按該細胞的常規消化方法消化分散,並在該細胞常用的營養液內作成分散的細胞懸液,傾入離心瓶內,以500r/min離心沉澱5～10分鍾,棄去上清液,於沉澱細胞內加入含10％DMSO或甘油的營養液(血清含量為10～15％),其量約為原營養液量的1／4。吹打混合並作必要的稀釋,使成每ml含2～5×106個細胞的懸液。應該強調指出,在將DMSO溶液加於沉澱細胞中時,必須一滴滴地緩慢加入,同時將離心瓶置於冰浴內,以免DMSO溶液產生潛熱,損傷乃至致死細胞。甘油和DMSO均應為分析純試劑。甘油用高壓滅菌,DMSO用濾器過濾除菌,兩者均分裝於小瓶,緊緊加塞後保存於普通冰箱內,不宜多次開啟,以免形成有毒的氧化產物。(2)裝瓿和封口:將上述細胞懸液分裝於1ml的硬質玻璃安瓿內。在距細胞懸液麵3cm處用酒精噴燈封口，以免燙死細胞。封口必須十分可靠，否則在由液氮中取出時可能發生危險的爆炸。因此，應將已經封口的安瓿置入05％甲基藍溶液中10分鍾。凡有藍色液進入的安瓿應即廢棄，並將合格的安瓿置自來水下衝淨後擦幹，準備冷凍。(3)冷凍：將細胞安瓿置於特製的預凍裝置內，使其溫度緩慢下降(每分鍾1℃)直至-20℃。此後即可將其迅速置液氮中。如果沒有特製的預凍裝置，可將細胞安瓿放入一個適合的紙匣內，襯墊棉花加以固定，切勿傾斜。匣外包裹3層棉花，每層厚1cm，再用橡皮帶紮緊,隨即置4℃冰箱內6小時，取出後置入-20℃冰箱內24小時。在由-20℃冰箱內取出後，迅速除去棉花層，並從匣內取出安瓿，立即浸入液氮保存。液氮罐由低溫合金鋼製成，配有提壺。在灌入液氮後，即可將提壺直接浸入液氮內。為防止安瓿漂浮，可在安瓿上放一些玻璃珠壓住。當液氮罐內的液氮蒸發過半時，即需加灌新的液氮。根據液氮罐的容量和使用情況，例如開啟的頻度等，一般每15～25天加灌一次新的液氮。由於液氮罐內不斷逸出氮氣，故應將其置於通風良好的房內。(4)複蘇和培養：需取用細胞時，可用竹鑷子取出細胞安瓿，迅速投入37～40℃的水浴鍋內，加蓋並適當搖晃，使冰凍的細胞迅速融解(40～60秒內)。隨即取出已融化的細胞安瓿，用75％酒精消毒後，用安瓿鋸鋸開頸部，用幾層滅菌紗布掰除安瓿頂部後，用毛細吸管吸出細胞懸液，置入培養瓶，並於每ml細胞懸液內加入10倍量預熱至37℃的營養液。營養液中的血清含量提高至10%～15％。置37℃的CO2溫箱內培養4～12小時。在細胞貼壁後，即可換入新的營養液，繼續培養至長成單層後換液，並考慮傳代。也可在細胞懸液內加入10倍量營養液後，即以500r/min的速度離心沉澱10分鍾，傾棄上清層，徹底除去保護劑，再在沉澱細胞內加入營養液，充分混懸後分瓶培養。營養液的最後加入量以原培養的細胞營養液為準。例如由10ml細胞培養物製成的冷凍細胞，在融解和離心沉澱後可再懸浮在10ml營養液中進行培養。如果低溫保存條件不理想，例如冷凍速度不夠緩慢……等等，則因細胞死亡較多，最後的營養液量可減半。細胞計數時，每ml營養液中的活細胞不應低於20～30萬。如果沒有液氮設備，可將上述已經預凍處理的細胞安瓿置-70℃冰箱內。在液氮中保存1～2年的細胞，活存率一般可達80%～90％，而在-70℃冰箱內保存同樣時間的細胞，活存率不到10％，有時隻有3％左右。液氮操作必須十分小心,應穿戴防護服、麵罩和手套，特別注意防護眼睛。沒有封嚴或有裂紋的安瓿中可能滲入液氮，當由液氮中取出時，因液氮快速蒸發而發生劇烈爆炸。皮膚接觸液氮也會引起嚴重凍傷。近來改用塑料安瓿，就比較安全了。
〖JZ〗附：細胞培養物中支原體的消除〖HT〗支原體是組織培養中最常見的汙染微生物，但因組織培養液中的支原體即使高達每毫升106～108個菌落形成單位(CFU/ml)的濃度，通常仍不引起嚴重的細胞病變，組織培養液也不明顯渾濁。因此，支原體汙染又是一個常被忽視的問題。然而必須指出，組織培養液中大量支原體的存在和增殖，必然大量消耗營養液中的營養成分，特別是氨基酸，如精氨酸等，這就間接地影響細胞的生長和增殖，甚至導致細胞退行性變化。據某些學者統計，原代細胞培養物的支原體汙染率為1%～3％，而繼代細胞株和傳代細胞係中的支原體汙染率高達45%～92％。這可能是支原體在傳代培養過程中大量增殖的緣故。組織培養細胞中的支原體，既有細胞源性的，也就是由細胞本身帶來，但更可能來自毒種、動物血清甚至胰酶，也有來自操作人員口、鼻和手的汙染。迄今尚無消除組織培養細胞內支原體汙染的簡單有效方法，學者們推薦了一些方法，例如：(1)抗生素處理，常用的藥物有聚對內稀茴香醚、卡那黴素、金黴素、四環素、泰樂黴素、新生黴素、慶大黴素、磺酸鹽以及5〖DK〗溴尿嘧啶等；(2)進行細胞克隆(見細胞克隆技術)，但在克隆前要將汙染細胞用抗生素處理並作較高倍數稀釋後傳代培養，維持液中同樣應含有抗生素，如上連續傳代3～4次後，進行細胞克隆；(3)向培養液中加入特異的抗支原體高免血清，可同時與抗生素聯合使用；(4)在41℃溫度連續感作18小時；(5)共生培養，與巨噬細胞共培養以去除支原體。上述方法能在一定程度上降低組織培養細胞內的支原體滴度，但常難以徹底清除。而在實施這些試驗之前，又需先作大量細致的預備試驗，例如測定組織培養細胞能否耐受41℃18小時的感作處理;測定組織培養細胞能夠耐受的抗生素濃度;了解抗血清的加入是否影響細胞的生長和增殖等等。綜合應用上述方法，例如於營養液內同時加入卡那黴素(100～200μg/ml)和高免疫血清(其在營養液內的最後濃度為5％)，效果似乎更好一些。通常是在每代培養物中加藥，每周傳代一次，連續4周。毒種、血清和胰酶等也應預先處理。毒種可用大量抗生素處理，即在每ml毒種內加入1mg的卡那黴素或200～500μg的金黴素或四環素。血清以56℃30分鍾滅活，必要時再用孔徑為01μm的濾膜或濾板過濾；胰酶也作這樣的濾過處理。劉洪等1992報道，應用BM-Cyclin(一種抗生素)和MRA(MycoplasmaRemovalAgent)處理10個汙染支原體的細胞係，效果顯著。一個處理過程即可全部去除細胞中的支原體。處理後的細胞形態正常，生長快，且提高了對病毒的敏感性。檢測組織培養物中的支原體，主要應用培養法，即取1ml組織培養液或01ml細胞懸液加入10ml支原體液體培養基內，37℃培養1周，此時培養基可能因支原體生長而變色或稍呈現渾濁，即可轉種於4個支原體固體培養基平板上。將其中2個平板置普通溫箱，另2個平板置5％CO2溫箱中，37℃孵育2周後檢查支原體菌落。支原體菌落極小，直徑在50～500μm之間，難用肉眼清楚看到，故常需用100×左右的低倍顯微鏡觀察。支原體菌落中心致密，邊緣較薄，呈油煎雞蛋樣。
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