病毒蝕斑技術
病毒蝕斑，又稱空斑，是指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。將適當稀釋的病毒懸液接種敏感的單層細胞，再在單層細胞上覆蓋一層固體介質，例如瓊脂糖、甲基纖維素等，則當病毒在最初感染的細胞內增殖後，由於固體介質的限製，隻能進而感染和破壞鄰近的細胞。經過幾個這樣的增殖周期，就將形成一個局限性的肉眼可見的變性細胞區，直徑小到1～2mm，大至3～4mm，這就是蝕斑。某些病毒在一般單層細胞培養內不形成CPE，但是卻可在加入覆蓋層後形成可見的蝕斑。因此可用蝕斑方法進行此類病毒的檢測。混懸於瓊脂等固體介質中的稠密細胞，在接種病毒後，也可產生蝕斑。為了便於觀察，常在覆蓋瓊脂中加入使細胞著染的染料。這些染料或著染死細胞而不染活細胞，如台盼藍；或著染活細胞而不著染死細胞，如中性紅。中性紅是蝕斑技術中最常應用的一種染料。這種染料在中性時呈紅黃色，偏堿時變黃，偏酸時呈玫瑰色。在以中性紅著染的細胞培養瓶內，當蝕斑長到1mm直徑以上時，可在白色襯底上清楚看到紅色背景中不著色的蝕斑。某些病毒，例如新城疫的某些變異株和SV40病毒感染的細胞，其對中性紅的親和力反而高於未感染細胞，因此可形成紅色蝕斑。從理論上講，一個病毒粒子可以形成一個蝕斑。反過來說，每產生一個蝕斑，也就是說明原接種物中含有一個活的病毒粒子。但是實際情況遠非如此，因為並非每個病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作過程中也常有許多病毒粒子滅活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能夠遇上合適的敏感細胞。根據電子顯微鏡的觀察，經常是幾百個乃至上千個病毒粒子才能形成一個蝕斑，即使在最好的試驗條件下，例如應用增殖力和抵抗力較高的病毒、敏感的細胞以及十分嚴密和適當的實驗條件，也需幾十個病毒粒子才能產生一個蝕斑。因此，以蝕斑形成單位(PFU)表示病毒懸液中的感染病毒濃度，似乎更為確切，例如說某個病毒懸液每ml含有108個PFU……等等。病毒蝕斑技術的原理，實際上就是將病毒懸液作連續的10×稀釋，隨後各取定量，接種於已經長成單層的敏感細胞上，並覆蓋中性紅瓊脂，待其出現蝕斑後計數，即可算出病毒懸液中每ml所含的蝕斑單位。例如在接種02ml病毒懸液的細胞瓶中出現36個蝕斑，則每ml病毒懸液的蝕斑形成單位就是1/02×36=180個，亦即180PFU/ml，當然也可寫成36PFU/02ml。蝕斑技術主要用於病毒純化，亦即挑選病毒克隆株(Clone)。由於病毒的遺傳變異，一般所用的病毒懸液或所謂的病毒株，實際上都是由許多在特性上不盡一致的病毒粒子組成的混雜群體。應用蝕斑技術，也就是根據蝕斑的不同的性狀、產斑條件和產斑時間等進行挑斑，可以從這類混雜群體中挑選出各個不同的純化病毒，亦即克隆株。近年來，許多弱毒疫苗株就是通過蝕斑技術選育而成。我們實驗室應用蝕斑技術從狂犬病弱毒株中，分離獲得了免疫性顯著優於其親本株的SRV9克隆株。而在弱毒疫苗的生產中，也需經常地通過蝕斑技術選出克隆株，借以保證疫苗株穩定的免疫原性和弱毒特性。蝕斑技術還是測定病毒懸液中感染病毒含量的一個準確方法。因為組織培養細胞的敏感性比較一致，培養條件也易統一，所以蝕斑技術已在許多動物病毒的滴定中取代了實驗動物滴定法。由於特異性抗體能夠抑製病毒產生蝕斑，故可應用蝕斑技術測定動物血清或其他體液內的中和抗體，亦即所謂的蝕斑抑製試驗和蝕斑減數試驗，詳見本書第十四章。目前應用的蝕斑技術，主要有單層法和懸浮法，現分別介紹如下。〖HT4SS〗〖JZ〗(一)單層法〖HT〗單層法是目前最常應用的一種方法，多用於病毒克隆化(挑斑)以及病毒毒力的滴定。此外，病毒遺傳變異研究以及蝕斑抑製或蝕斑減數試驗等血清學技術亦在此基礎上進行。主要步驟如下：(1)先將敏感細胞在培養瓶或平皿內培養成單層。如果有CO2溫箱，使用24孔培養板更為方便，當然也可使用平皿。蝕斑試驗時的細胞接種量要大，通常為每ml200～400萬個細胞。(2)傾棄或吸棄營養液，加入Earle氏洗液衝洗單層細胞，或者加入不含血清的維持液——pH74～76的05％乳白蛋白水解物Earle氏液，37℃浸泡一小時後傾棄，洗去脫落的死亡細胞，並可將細胞間隙中殘留的血清充分洗出，以減少血清對某些病毒可能有的非特異性抑製作用。(3)以不含血清的維持液(腦炎類病毒可用滅菌的10％脫脂牛乳生理鹽水)將病毒作連續的10倍稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養瓶或孔內的單層細胞，接種量約為原營養液的1／10～1／20，每個稀釋度至少接種3瓶(或孔)。置37℃感作1～2小時，使病毒充分吸附。某些病毒的吸附較慢，可將感作時間延長到2小時以上。吸附完畢後，吸出病毒液。有人建議再用Earle氏液或無血清維持液洗滌細胞一次，作者認為並不十分必要，特別是對抵抗力低的病毒，因為未吸附的病毒將在37℃培養期間自行滅活。(4)取含中性紅的營養瓊脂糖(配製法見本節附錄)，融化後降溫至43～45℃,注入細胞培養瓶內無細胞的一麵，再將培養瓶緩慢翻轉，使營養瓊脂糖覆蓋在細胞表麵，厚度約2mm，以不超過3mm為宜。平放30～60分鍾，待瓊脂糖凝固,隨後置37℃繼續培養。由於中性紅是光動力活性染料，遇光時產生對病毒呈現毒性作用的物質。故將中性紅營養瓊脂糖注入細胞培養瓶後，應立即用黑紙或黑布蓋住，置37℃培養時也要放在暗匣內避光，此後逐日觀察一次細胞形態以及出斑情況,見圖11-2。〖JZ〗圖11-2狂犬病毒Flury株在BHK〖DK〗21細胞上的蝕斑(左),右為健康對照〖JY,8〗自嶽軍明某些病毒的出斑時間較晚，例如馬傳染性貧血病毒的蝕斑實驗，可以采用雙層瓊脂糖法，即在給單層細胞接種病毒後，先覆蓋第一層不含中性紅的營養瓊脂糖，5～6天後，再加入內含中性紅的第二層營養瓊脂糖層，繼續培養(避光)，並逐日觀察細胞形態和出斑情況。作者等的具體方法是：取已長成單層的驢胎繼代細胞，傾棄營養液，接種適當稀釋的病毒液(細胞培養毒)，例如10-3、10-4、10-5，每個培養瓶接種05ml(10ml培養瓶)，37℃感作2小時，吸棄殘留的病毒液，加入融化並冷卻至43～45℃的第一層瓊脂糖8ml(見本節附錄)，逐日觀察細胞。於第6～7天，當細胞開始出現粗糙現象時，加入內含中性紅的第二層瓊脂糖(見本節附錄)，每瓶3～4ml,置暗匣內繼續培養，第2～3天後即可出斑。出斑數與病毒液的濃度基本相符。對出斑時間較遲和中性紅敏感的病毒，覆蓋層中不加中性紅，而根據病毒的出斑時間，在培養後的適當時機，單獨應用中性紅溶液染色，同樣能獲得輪廓清晰、形態規整的蝕斑。〖HT4SS〗〖JZ〗(二)懸浮法〖HT〗懸浮法主要用於不能增殖的細胞，例如血液或腹腔巨噬細胞等等，但也有人用於其它可以分裂增殖的細胞。懸浮法不宜用於大型病毒，因為這類病毒在瓊脂糖中不易擴散。(1)先在培養瓶或平皿底部覆蓋一層營養瓊脂糖，使其形成2mm厚的底層，待其凝固；(2)根據細胞種類，用無血清維持液稀釋成適當濃度的細胞懸液，例如Vero細胞和BHK細胞可用每ml600萬個細胞的濃度，原代倉鼠腎、雞胚細胞和巨噬細胞可用每ml1000萬個細胞的濃度；(3)吸取上述細胞懸液，置滅菌試管中，每管16ml，再加入無血清維持液稀釋的(例如10-3～10-8)病毒懸液04ml，每個稀釋度最少接種3管；(4)充分振蕩混合後置37℃溫箱內感作30分鍾，並定期振蕩；(5)每管加入等量(2ml)的43～45℃營養瓊脂糖，迅速混勻後倒入培養瓶(10ml培養瓶)內的底層瓊脂上，平放待其凝固；(6)根據各種病毒可能的出斑時間，於3～4天或更長一些時間後加入4～5ml001%中性紅溶液(見本節附錄)，37℃感作一小時；(7)吸棄多餘的中性紅溶液，觀察蝕斑。如果還未出斑，可將培養瓶繼續置暗匣內培養，直至出現清晰的蝕斑。利用懸浮法挑斑，同樣也可在24孔細胞培養板上進行。〖HT4SS〗〖JZ〗(三)挑斑法〖HT〗為了分離病毒克隆株，在培養瓶內出現清晰的蝕斑時，即可進行挑斑。最好選擇蝕斑數較少，各斑間的距離不小於10mm的培養瓶。先在選定的蝕斑部位的瓶壁上做好標誌，隨後應用帶有橡皮乳頭的彎頭吸管直接吸取選定的蝕斑——連同瓊脂糖一起。如係平皿內的蝕斑，則可直接用吸管吸取之。將吸取的蝕斑瓊脂糖洗入05～1ml營養液內，反複凍融三次，使病毒充分釋放，用之接種敏感細胞,待其充分增殖以後，考慮再作下一輪的蝕斑純化，並挑斑。如此操作三次，一般可達到純化目的。〖JZ〗〖HT4H〗附錄
1.瓊脂糖〖HT〗是從瓊脂中去除對細胞有毒性作用的瓊脂膠後,精製出的一種線性多糖。它對細胞既無毒性,又能形成透明的半固體狀態,有利於挑斑,所以是蝕斑技術常用的覆蓋物。以各廠家生產的瓊脂糖配製的凝膠硬度不盡相同,實踐中可以適當調整其含量。此外,甲基纖維素也很好,但由於它製備的覆蓋層呈半液體狀態,雖適於病毒的毒力滴定和中和抗體檢測,但用於病毒克隆則比較困難,不好挑斑。〖HT5H〗2.中性紅〖HT〗各廠家生產的中性紅的質量明顯不同,即使同一廠家生產的不同批號的中性紅,質量也不一致。因此必須通過對比試驗,慎重選用同一批號的產品。保存時還應避光、避熱、避潮。保存多年的中性紅,質量下降,似乎還增高毒性。配製1∶1000或1∶10000中性紅溶液時,可將中性紅粉直接溶於去離子水配製的085%NaCl液中。8磅高壓滅菌,使其徹底溶解,無菌分裝於褐色瓶內,置4℃冰箱保存備用。營養瓊脂糖內中性紅的最後濃度以1/28000～1/36000為宜。
3營養瓊脂糖〖HT〗根據細胞和病毒種類的不同,選擇下列某一種營養瓊脂糖。雞胚原代細胞一般用05%乳白蛋白水解物-犢牛血清營養瓊脂糖,作痘病毒和腦炎病毒的蝕斑試驗,常能取得滿意結果。哺乳動物腎細胞、二倍體細胞和傳代細胞則常應用以199或E〖CD*2〗MEM等配製的營養瓊脂糖。(1)05%乳白蛋白水解物-犢牛血清營養瓊脂糖:首先配製乳白蛋白水解物瓊脂糖,取:〖WX(!31KG5,3YQ〗Earle氏液(10倍濃縮,不含酚紅和碳酸氫鈉)〖〗18ml〖〗乳白蛋白水解物〖〗09g〖〗瓊脂糖〖〗12g〖〗去離子水〖〗140ml〖WX)〗將上述各成分混合,煮沸溶解,然後分裝小瓶,8磅高壓滅菌15分鍾,4℃保存備用。用前將其置於沸水浴中加熱融化,待溫度降至43～45℃時按下列比例配成營養瓊脂糖:〖WX(!31KG5,3YQ〗乳白蛋白水解物瓊脂糖〖〗80ml〖〗犢牛血清〖〗45ml〖〗1:1000中性紅溶液〖〗25ml〖〗75%碳酸氫鈉溶液〖〗25ml〖〗青、鏈黴素溶液(每ml分別含青、鏈黴素1000單位)〖〗08ml〖WX)〗配好後,振搖混合,置43～45℃水浴中保溫備用。如此配製的營養瓊脂糖的pH為72～74,應呈紅黃色,必要時適當調整pH。(2)E〖CD*2〗MEM犢牛血清營養瓊脂糖I:先將E〖CD*2〗MEM配成2倍濃度的使用液,再在無菌條件下以NaHCO3液調整pH至74,加溫至43～45℃。按下方加入各成分:〖WX(!31KG5,3YQ〗2倍濃度的E〖CD*2〗MEM(以不含酚紅的Earle氏液配成)〖〗100ml〖〗1:1000中性紅溶液〖〗6ml〖〗犢牛血清〖〗4ml〖〗2%瓊脂糖(以去離子水配成,pH為74,高壓滅菌備用)〖〗100ml〖〗青、鏈黴素溶液〖〗2ml〖WX)〗充分混合後應用。(3)E〖CD*2〗MEM犢牛血清營養瓊脂糖II:首先按下列配方配製成2倍濃度營養液:〖WX(!31KG5,3YQ〗10倍濃度的E〖CD*2〗MEM(用不含酚紅的Earle氏液配成)〖〗20ml〖〗3%穀氨酰胺〖〗2ml〖〗犢牛血清〖〗36ml〖〗88%碳酸氫鈉溶液〖〗5ml〖〗青、鏈黴素溶液〖〗2ml〖〗去離子水〖〗644ml〖〗1∶1000中性紅溶液〖〗3ml〖WX)〗另取2%瓊脂糖(配法同前),水浴融化後保持於43～45℃,加入等量已加溫至43～45℃的上述2倍濃度營養液,充分混合後保存在43～45℃中待用。(4)雙層營養瓊脂糖:包括不加中性紅的第一層瓊脂糖和加中性紅的第二層瓊脂糖。〖ZZ6〗第一層瓊脂糖〖WX(!31KG5,3YQ〗05%乳白蛋白水解物Earle氏液配製的08%～1%瓊脂糖(不含酚紅)〖〗45ml〖〗犢牛血清〖〗6ml〖〗75%碳酸氫鈉溶液〖〗09ml〖〗3%穀氨酰胺〖〗1ml〖〗青、鏈黴素溶液〖〗06ml〖WX)〗混勻後置43～45℃水浴保溫備用。〖ZZ6〗第二層瓊脂糖〖WX(!31KG5,3YQ〗05%乳白蛋白水解物Earle氏液配製的08%～1%瓊脂糖(不含酚紅)〖〗30ml〖〗75%碳酸氫鈉溶液〖〗14ml〖〗1∶1000中性紅溶液〖〗26ml〖〗犢牛血清〖〗3ml〖〗青、鏈黴素溶液〖〗04ml〖WX)〗混勻後置43～45℃水浴保溫備用。
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