超薄切片法是研究病毒特征以及病毒與細胞之間相互作用的有效手段。圖12-5是生長在雞胚羊膜細胞上的馬甲2型流感病毒。可從圖中清楚看到馬甲2型流感病毒粒子的形態。病毒粒子沿細胞表麵整齊排列，其遠離細胞表麵的一端比近端電子密度大。並可看到病毒粒子從細胞膜上芽生。 圖12-5 生長在雞胚羊膜細胞上的馬甲2型流感病毒 ——自賈補年等切片厚度很薄，需在01μm以下，用環氧樹脂作包埋劑，一般可以製成5～70nm厚度的切片。超薄切片的製備包括固定、脫水、包埋、切片和染色。 1.固定 固定的目的，是終止細胞的生化過程，保持細胞原來的微細構造，避免細胞自溶和造成人為假像。我們要研究的材料是各種各樣的，材料本身的構造不同，各有特點，其固定條件也要隨研究材料的不同而選擇，不能千篇一律。一般說來，要求固定液能在固定期間維持一定的pH值；具有適當的滲透壓，防止固定期間細胞或細胞器腫脹或收縮；具有適當的離子濃度，防止固定期間某些物質的沉澱或抽出。固定液本身應無毒性或毒性較小。為此，固定液要用緩衝液配製。 (1)固定劑和緩衝液的性質：超薄切片用固定劑有戊二醛、四氧化鋨、多聚甲醛、高錳酸鉀等，常用的是前兩種。 商品戊二醛［CHO(CH2)3CHO)］是25％或239％的淡黃色水溶液，也有的是50％的水溶液。戊二醛應在4℃或-20℃低溫避光貯存，長期室溫貯存易形成聚合體。與細胞起反應的主要是戊二醛單體，單體的最大吸光度在280nm，聚合體的最大吸光度在350nm，故可用分光光度計測定戊二醛的純度。Kurstak指出，OD２35/OD280比值大於3即顯著降低其交聯作用。不純的戊二醛可用活性炭濾過或蒸餾純化。活性炭純化法是在市售25％的戊二醛中加入10％(W/V)的活性炭，4℃搖動1小時，然後濾過，可重複數次，直到吸收光譜達到標準為止。 戊二醛的主要特點是：兩個醛基可與細胞成分發生交聯，對糖原和核蛋白，尤其是對微管和內質網等膜係統以及細胞基質有較好的固定作用；對組織的穿透力強，可固定數毫米的組織塊；可保存某些酶的活性，對脂質不起固定作用。用戊二醛固定的組織，於4℃保存數周至數月不產生明顯變化。 商品四氧化鋨(OsO4)呈淡黃色或無色結晶。溶點395～410℃，沸點130℃，溶於水、酒精、醚和氯仿等，在水內的溶解度是61g/100ml(18℃)，其水溶液不呈酸性。通常以玻璃安瓿包裝，每個安瓿為05g或1g。 四氧化鋨的主要特點是能固定蛋白質。所以，雖然對核酸和碳水化合物的保存較差，但機體內核酸和碳水化合物都與蛋白質呈複合的形式，因而，四氧化鋨幾乎能和所有的細胞成分結合。四氧化鋨與脂肪的不飽和脂肪酸鏈結合，形成脂肪鋨複合物，對脂肪呈現良好的保存作用；但不能保存糖原，對微管的固定作用較差。四氧化鋨分子大，擴散慢，對組織的穿透力較差，被固定的組織塊不能大於1mm3。四氧化鋨分子的密度大，具有電子染色作用。 多聚甲醛是單功能試劑，不起交聯作用。它的最大特點是穿透力強，因而可較好地固定大塊組織。多聚甲醛可保存蛋白質、脂類和一些糖原，但不能保存多糖。多聚甲醛固定的組織呈可逆反應，因此漂洗時要注意。 電子顯微鏡技術常用的緩衝液有磷酸緩衝液、二甲胂酸緩衝液和巴比妥醋酸緩衝液。 磷酸緩衝液的配方甚多，效果相差不明顯。這種緩衝液比其它幾種緩衝液更符合“生理”條件，對細胞和操作者無毒性，因而使用很廣。其缺點是在固定期間可能出現沉澱，汙染樣品。 二甲胂酸緩衝液的優點是容易配製，溶液本身不利於微生物的生長，長期貯存穩定，加入低濃度(1～3mmol/L)的鈣不發生沉澱。主要缺點是含胂，而胂是有毒物質。 巴比妥醋酸緩衝液與上兩種緩衝液比較起來，優點是不形成沉澱，缺點是緩衝力小。由於巴比妥鈉能與醛起反應而失去緩衝力，所以這種緩衝液不能配製戊二醛固定液。 (2)固定時間和溫度的選擇：要根據樣品的性質、大小和固定液的成分決定固定的時間和溫度。要選擇適當的溫度和時間，使得固定液和樣品剛好起反應。時間過長，固定液將抽出樣品中的某些成分，增加人工損傷，如戊二醛長時間固定會形成一種髓鞘樣圖形，四氧化鋨長時間固定會抽出細胞質基質的許多蛋白質；固定時間過短，則固定不完全。 一般來說，較致密的樣品，固定時間要長些，疏鬆樣品固定時間較短。樣品塊大，固定時間要長。有些樣品在室溫下固定效果好，有些樣品則需要較低的溫度，即0～4℃固定效果較好。溫度低，樣品的酶活性低，可減慢自溶，但固定液的滲透亦慢，為此，將延長固定時間。溫度高，樣品的酶活性高，自溶速度快，但固定液的滲透亦快，固定速度就快。在0～25℃間，看不出有顯著差別，但最常用4℃固定。 (3)固定方法：電鏡工作者現已公認戊二醛和四氧化鋨雙固定的標準固定方法，即所謂的通用固定法，包括初固定、漂洗和二次固定等步驟。 初固定(或前固定)：用25％戊二醛(01mol/L磷酸緩衝液，pH74，含有25mmol/L的氯化鈣)或2％的多聚甲醛加25％戊二醛4℃固定1小時。 漂洗：用磷酸緩衝液(01mol/L，pH74，含25mmol/L氯化鈣)4℃洗1小時(其間更換3次以上漂洗液)。 二次固定(或後固定)：1％四氧化鋨(01mol/L磷酸緩衝液，pH74，含25mmol/L氯化鈣)室溫或4℃固定1小時。 先用戊二醛再用四氧化鋨的雙固定法有許多優點，一是戊二醛和四氧化鋨能保存的樣品成分不盡相同，雙固定法可以取長補短；二是樣品在戊二醛固定液內或經戊二醛固定後，可貯存較長的時間；三是戊二醛滲透速度快，可固定較大的組織塊，先用戊二醛固定樣品，便於切成適合於四氧化鋨固定的小塊。 戊二醛是還原劑，四氧化鋨是氧化劑，所以用戊二醛作為初固定後必須徹底洗去未反應的戊二醛，才能用四氧化鋨進行二次固定。 在固定前或固定中要對樣品進行適當的修整，否則將形成嚴重的人工損傷。一般要求： 快：力爭在半分鍾內將樣品浸入固定液。 小：常用固定液穿透力較弱，樣品塊應小於1mm３。 準：電鏡的放大倍數大，因而觀察的樣品麵積很小，所以，選擇部位要準。 利：要用非常鋒利的器械，通常用刮臉刀片切割，避免因牽拉和擠壓造成人工損傷。 樣品不同，固定過程亦不完全相同。在病毒學研究工作中，最常見者是組織培養的單層細胞和動物組織。 ①單層細胞的固定： 單層細胞多用沉澱塊法固定，即用橡皮刀或刮子刮下貼壁細胞，把細胞懸液倒入10ml尖底離心管內，1000～2000r/min離心10分鍾。 初固定：倒掉管內上清液，沿管壁慢慢加入0～4℃的2％戊二醛固定液，注意加時不要衝散沉澱塊。加入的固定液量要為沉澱塊體積的10倍以上。4℃下放15～30分鍾。 漂洗：取出沉澱塊，放在蠟盤上，加數滴4℃緩衝液(如用二甲胂酸鈉緩衝液漂洗，則要配成005～01mol/L濃度，每100ml緩衝液加入73g蔗糖，調整緩衝液的滲透壓)，用刮臉刀片把沉澱塊切成約1mm3大的立方塊，用鑷子或吸管放入帶蓋小玻瓶內，4℃用緩衝液漂洗3次以上，每次數分鍾，充分洗去未結合的戊二醛。 二次固定：倒掉漂洗液，加入4℃的1％四氧化鋨固定液，加入量約為樣品塊體積的10倍，4℃下放1～2小時。 在某些研究工作中，要求將細胞原位固定後再刮下離心，或者用多聚甲醛、四氧化鋨、高錳酸鉀作為初固定。在這些情況下，沉澱塊疏鬆，當進行下麵各過程時容易丟失樣品，為此，可把樣品懸浮在液態瓊脂中，凝固後切成小立方塊再進行漂洗和二次固定等過程，具體方法如下： a.用緩衝液配製成2％的瓊脂溶液，加熱融化備用。 b.把盛瓊脂緩衝液和沉澱塊的離心管都放在45～50℃水浴中加溫。 c.用一溫熱吸管吸一滴瓊脂(約003ml)溶液加入沉澱塊試管內，搖動，使細胞均勻懸浮在瓊脂中，浸10分鍾以上。 d.用溫熱吸管把懸液吸出滴在冷載玻片上形成1小滴。 e.凝固後把含細胞的瓊脂凝塊切成約1mm3的小塊進行漂洗、二次固定等。 要注意盡可能少加瓊脂，否則，切片上的細胞數量將很少。 也可全部都懸浮固定，即初次固定、漂洗、二次固定都用離心方法進行。二次固定後，再按上述方法包在瓊脂中，而後進行脫水等。 ②動物組織的固定：根據不同的研究目的用不同的方法。一般是直接從活體或殺死的動物體切取適當的組織放入固定液浸泡固定。有時需將動物麻醉，解剖出要研究的器官或組織，將固定液直接滴在這些被研究的器官或組織上，也可直接注入器官或組織內部，這樣可保證血液供給，避免因缺血造成的損傷。經這樣固定後，切取適當的組織在室溫或4℃繼續浸泡固定1小時。固定液用5％戊二醛為宜。以下過程與單層細胞沉澱塊法相同。有些研究者用灌注法固定，這種方法是用固定液逐步取代動物體內的血液來達到固定目的。其優點是固定效果好，缺點是需用固定液的量大，方法複雜，所以，除特殊需要外，不經常使用。 2.脫水 目前使用的大多數包埋材料不溶於水，因而需要把固定後的樣品脫水，才可使包埋材料浸入樣品內部，達到包埋目的。使用最廣的脫水劑是丙酮和乙醇。脫水劑需從低濃度到高濃度逐步過渡，否則將因組織急驟收縮而出現人工損傷。 常規脫水方法：此法用於單層細胞培養物。 50％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鍾 70％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鍾 95％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鍾 100％丙酮(或乙醇)，4℃，10～15分鍾 100％丙酮(或乙醇)，室溫，10～15分鍾 100％丙酮(或乙醇)，室溫，10～15分鍾 100％丙酮或乙醇要用幹燥劑吸水，一般使用烤幹的硫酸鈉或硫酸銅。 快速部分脫水方法(Robbins等，1967)： 20％乙醇80％水，室溫，30秒 60％乙醇40％Epon812，室溫，5分鍾 30％乙醇70％Epon812，室溫，5分鍾 100％Epon812，室溫，5分鍾 隨後即可用Epon812浸透和包埋。 環氧丙烷可快速與環氧樹脂混合，並且即使在包埋劑中殘留少許，聚合後也不會出現不良後果。所以，一些不易浸透的樣品在脫水後經過兩次環氧丙烷處理，每次15分鍾，隨後再浸透和包埋，這樣可減少浸透不完全的缺陷。脫水後的樣品要嚴防濕氣。因此，使用的器皿應是烤幹的，室內相對濕度以50％左右為宜。 3.包埋 包埋的目的是用包埋劑支持整個樣品結構，並形成特定的機械性能,以便於切片。 (1)包埋劑的性質及種類： ①理想包埋劑應具備的特性：單體時粘度低；聚合均一，體積變化小；容易切片；在電子束轟擊下穩定；電子透明度好，不形成背景反差；易溶於脫水劑；不同批號的產品，性能一致；價格低廉，容易獲得。 ②包埋劑種類： a.環氧樹脂類 Epon812和Quetol812以及國產環氧樹脂618是常用的包埋劑，尤其是Epon812更為常用，它是由甘油和表氯乙醇反應而來的7個單體組成，對電子束穩定，但由於含有較高的疏水成分，故粘性較大，且因含二環氧化物而有致癌性。618為二酚基丙烷型環氧樹脂，是目前使用較多的國產環氧樹脂，它對組織損傷小，保存結構精細，特別是對膜性結構保存更好，但粘度大，浸透不均勻，操作不太方便，若與國產600型環氧樹脂混合使用，可降低其粘度。Araldites屬芳香族類，對熱及電子束有很好的穩定性，交聯程度低，粘度小是其優點；Spurr(ERL4206)是一種乙烯環已烷二氧化物，由長鏈脂族酐交聯，它在環氧樹脂類裏是粘度最低的，但缺點是毒性大並具有致癌性。Durcupon為脂族多聚環氧化物，粘度低，因它與非水溶性的其它環氧樹脂和水溶性的異丁酸類樹脂都具有親和性，常用來做浸透劑，以代替環氧丙烷。 b.丙烯類樹脂 Lowicryl是一類重要的丙烯樹脂，為極性丙烯酸和異丁酸酯，由脂族乙二醇二異丁烯酸交聯，與Epon一樣對電子束穩定，在低溫下具有粘度低，脫水快和浸透好的特點，聚合時用苯偶姻甲酯作始動劑，在波長360nm紫外線間接照射下低溫(-30℃～-50℃)聚合過夜。Lowicryls包括親水性的K4M、K11M及疏水性的HM20、HM23。前二者的脫水劑可用甲醇、乙醇、丙酮、甘油等，因其在組織含有5％水分時也可聚合，所以浸透可在部分水化狀態下進行，後二者的脫水劑不能用甘油和乙二醇，它可在-70℃下使用，許多生物物質可保持穩定，甚至可保存結合水。LRWhite與LRGold是親水性丙烯酸單體混合物，交聯穩定，粘度低，可迅速浸透組織，對電子束穩定，組織經70％酒精脫水即可進入LRWhite中浸透，聚合可在50℃或室溫下進行，如果使用加速劑則可在10～20分鍾內聚合。丙酮在該樹脂內可作為一種自由基清除劑，隻要有一點丙酮殘留都會影響聚合，因此一般不用丙酮作脫水劑。在聚合時要注意盡量減少氧氣的存在，用帶蓋膠囊聚合。GMA是由乙二醇甲基丙烯酸酯組成，含有3％水分，多用於細胞化學研究，不需去除樹脂就可用很多特殊染料染色，組織先在含有70％蔗糖緩衝液中放置，然後用含水量漸少的GMA及純GMA浸透包埋，於紫外線照射下4℃聚合。 (2)包埋劑的配製： 目前最常用的是環氧樹脂類。環氧樹脂是一種熱塑性樹脂，呈蜜黃色半液體狀，有環氧基和羥基兩種化學反應基團，當與一定的酸酐(如順丁烯二酸酐、十二烷基琥珀酸酐和甲基內次甲基四氫苯二甲酸酐等)混合後，在一定溫度下交聯成穩定的網狀大分子結構，其機械性能取決於單體和硬化劑(即酸酐)的比例，因此，選擇適當的配比，才能保證切片質量，例如，當用Epon812時，一般選酸酐與樹脂的比為07。 ①618包埋劑配方Ⅰ [FL(] 環氧樹脂618 順丁烯二酸酐 苯二甲酸二丁酯(簡稱DBP) 二乙基苯胺5ml2g15～2ml04ml 將環氧樹脂618倒入燒杯內，加熱至80℃，用注射器或量筒量取所需量的環氧樹脂618置廣口玻瓶內，加入順丁烯二酸酐，放入80℃溫箱中約5～10分鍾，使其溶解(因順丁烯二酸酐的溶點為56℃左右，需加溫溶解)，用磁攪拌器或玻棒攪拌5～10分鍾，攪拌均勻後冷至室溫，用注射器加入DBP，攪拌均勻後備用。用前半小時左右，用帶針頭的小注射器在攪拌情況下，逐滴加入二乙基苯胺，加完後繼續攪拌5～10分鍾即可使用。 ②618包埋劑配方Ⅱ 環氧樹脂618 十二烷基琥珀酸酐(DDSA) 6ml4ml 2,4,6三(二甲氨基甲基苯酚)(DMP30)01ml 用注射器或量筒量取618和DDSA，充分攪拌均勻後逐滴加入DMP30，邊攪邊滴，加完後繼續攪拌5～10分鍾。溶液比較粘稠，可放37℃溫箱使其變稀，氣泡逸出。用前半小時配製。 ③618包埋劑配方Ⅲ 考慮到618配方Ⅱ比較粘稠，聚合塊較脆，加入DBP增塑劑後，易於切片。 環氧樹脂618 DDSA DBP DMP30 6ml 4ml 03～08ml 03～02ml ④Epon812包埋劑配方 A液： Epon812 DDSA B液：Epon812 62ml 10ml 10ml 甲基內次甲基四氫苯二甲酸酐(MNA) 89ml DMP30占總重量的15％ 先配製成A液和B液備用。使用前將A液與B液按一定比例混合後攪拌均勻，然後邊攪拌邊滴加DMP30，攪拌均勻。A液和B液的比例隨氣候而改變，通常冬天使用A∶B＝2∶8，夏天使用1∶9或純B液。A液多，聚合塊軟；B液多，聚合塊硬。通常根據環氧值計算的重量百分比，按表12-2的配方進行配製。 表12-2 環氧樹脂包埋劑的配製 包埋劑數量(g) MNA(g) DDSA(g) E(g) DMP30(g) 10 30 15 55 015 20 60 30 110 030 30 91 45 164 045 40 121 60 219 060 50 151 75 274 075 (3)浸透： 浸透是用包埋劑置換樣品內的脫水劑或中間溶劑。這一步一定要徹底，否則得不到好的切片。如果用環氧丙烷作脫水劑與包埋劑的中間溶劑，雖殘留少量環氧丙烷並不影響切片質量。 一般情況下，可先用脫水劑和包埋劑1∶1混合液過渡，然後再用純包埋劑置換。如果樣品較致密，可用脫水劑和包埋劑2∶1、1∶1、1∶2混合液、純包埋劑逐步置換，也可用環氧丙烷作為中間溶劑置換脫水劑，再用環氧丙烷與包埋劑1∶1混合液和純包埋劑置換。把樣品放在慢速振蕩器上浸透，可收到很好效果。此外，減壓也可促進浸透。 (4)聚合：聚合就是將已浸透的樣品固化。有兩種聚合方法，一是加溫，二是紫外線照射。加溫是常用方法，大多數環氧樹脂包埋劑於60℃12小時即可固化，50℃約需2天，70℃約需8小時。一般用35℃、45℃、60℃各12小時聚合，或60℃24～48小時聚合。某些組織化學樣品，加溫將破壞其中一些成分，如酶活性等，則可用紫外線照射聚合，50℃需48小時，40℃需70小時。 (5)水溶性包埋劑包埋方法：樣品經固定水洗後不必經過脫水，可直接進入各級Durcupan中，最後入Araldite包埋。
其具體步驟如下： 50％ Durcupan水溶液 20分鍾
↓ 70％ Durcupan水溶液 20分鍾
↓ 90％ Durcupan水溶液 20分鍾 ↓ 100％ Durcupan溶液 40分鍾 ↓ 100％ Durcupan溶液 40分鍾 ↓ Durcupan∶Araldite(3∶1) 60分鍾 ↓ Durcupan∶Araldite(1∶1) 60分鍾 ↓ Durcupan∶Araldite(1∶3) 8～12小時 ↓ Araldite(純) 60分鍾 (6)LowicrylK4M低溫包埋劑包埋方法∶LowicrylK4M低溫包埋主要用於免疫標記電鏡樣品製備。將固定的細胞塊(樣品)，用01mol/L二甲胂酸緩衝液洗3次，每次10分鍾；再往50％、60％、70％、80％、90％、95％酒精脫水各5分鍾，100％酒精脫水3次，每次30分鍾；100％酒精∶樹脂(LowicrylK4M)＝2∶1、1∶1、1∶2，各1小時，純樹脂浸透過夜。最後包埋在特製的模具中，置於紫外線下-25℃，前1小時將溫度降至-25℃，然後開紫外線聚合24小時，室溫放置2天，常規切片。 附：LowicrylK4M配方 CrosslinkerA MonomerB MitiatorC2701730010 配製時按順序分別加入即可。 4.切片及其準備工作 (1)載網：載網由金屬製成，網孔的形狀、大小和數量可根據實驗要求選擇。常用的載網由銅製成，稱銅網。直徑為2mm或3mm，每英寸200～300目，網孔呈圓形或方形。銅網要徹底清洗幹淨，有條件時可用超聲波清洗，亦可用濃硫酸浸泡15分鍾左右，其間不斷攪動，而後用餾水反複衝洗，洗好後放在濾紙上吸幹備用。 (2)製膜：常用聚乙烯醇縮甲醛(formvar)膜。取025～03g聚乙烯醇縮甲醛，用三氯甲烷製成025～03％的溶液密閉備用。製膜時，手持表麵無劃痕的潔淨玻片浸入上述溶液中，隨即慢慢提出，在液麵上停留1～2分鍾，使溶劑揮發。室溫自然幹燥後用刀片在玻片四周劃切，然後將玻片與水麵呈45度角緩緩壓入水中，借助燈光可見隨著玻片的壓入一層薄膜漂浮在水麵上。將潔淨銅網一個個擺在薄膜上，把比膜稍大的濾紙條蓋在載網上，用手指壓入水麵後在水內翻轉180度托出水麵，烤幹備用。如果需要，可在製好的膜上噴一層碳膜，加強膜的機械強度。加碳膜是在真空噴鍍儀內進行的，噴碳時在膜附近放一小塊白色瓷片，瓷片上預先滴一小滴擴散泵油，根據瓷片上的顏色大略判斷碳膜的厚度，一般瓷片呈淡茶色即可，膜厚約10nm。 (3)修塊：修塊的目的是去除組織周圍的包埋介質和無關部分，使組織塊成為一定的形狀和大小，便於切片。修塊可在專門的修塊機或切片機上進行，亦可在解剖顯微鏡下用刮臉刀片手工修整。可把組織塊的表麵修成梯形、正方形或長方形等，但不管修成哪種形狀，其頂邊和底邊必須平行，否則不能形成連續切片帶。組織塊表麵積小些容易切片，一般邊長01mm左右即可。 (4)製刀：切片一般用玻璃刀，也可用鑽石刀。鑽石刀可以切較硬的樣品，但其價格昂貴，國內尚未大量生產，故未得到普遍應用。玻璃刀由5～7mm厚的硬質玻璃製成，製刀前要把玻璃清洗幹淨，用專門的製刀機製刀，成功率高，刀的質量好。無製刀機可手工劃割。 要在刀上裝一水槽，以便收集切片，水槽可用塑料膠布或氧化鋅橡皮膏圍成，刀與膠布接觸處要燙上一層蠟，以防漏水。也可使用塑料或金屬製的商品水槽。切片前應對刀的質量進行檢查，方法是將刀裝在切片機的刀座上，打開聚光燈，移動燈和刀刃的相對位置，用高倍鏡觀察，刀刃的最佳部分是一條平直亮線，呈鋸齒狀的部位不易切出好片，一般最佳刀刃部分約占整個刀刃長度的1/5～1/4。水槽內的液體一般用蒸餾水，水麵應和刀刃在同一平麵上，用熒光燈在適當位置上照射，液麵和刀刃的可用部分應呈白色，切片時隨時觀察切片情況。切片厚度不同，在燈光照射下可看到不同顏色的幹涉色，因而可大體判斷切片的厚度，一般認為： 暗灰色 40nm以下 灰 色 40～50nm 銀白色 50～70nm 金黃色 70～90nm 用樹脂包埋的組織塊，一般切成50～60nm的切片為好。 (5)切片：把已修好的組織塊夾入樣品夾內，裝在樣品臂上，把刀裝在刀座上，在顯微鏡下將刀的高度調節到與刀座上的參考規相等，旋轉組織塊使塊麵的兩個平行邊與刀刃平行，讓長邊在下方，塊麵中心線與刀刃處於同一水平線上，移動刀使可用部分對準塊麵，調好切片速度和間隙角後慢慢手動粗調旋轉鈕切下第一個切片後即可連續切片。切片速度、間隙角和刀尖角可根據不同的樣品試驗決定，一般切硬材料用較小的間隙角、較大的刀尖角和較慢的切速。較軟的材料宜用大些的間隙角、較小的刀尖角和較快的切速。通常，間隙角用3～5度，切速用2～10mm/秒，刀尖角用45度。 切到一定數量的切片後停止切片，打開切片機內部的冷卻風扇，用睫毛製成的“拔針”把切片歸攏集中，用鑷子夾住載網邊緣直接在水麵上貼取切片，用細濾紙條從網邊吸去液體，自然幹燥。切片機在用風扇冷卻10分鍾後，即可關掉風扇進行再切。 5染色 目前，最常用的超薄切片染色法是醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色法。 (1)染液的配製： 醋酸鈾飽和乙醇溶液 醋酸鈾 50％乙醇5g50ml 把醋酸鈾和乙醇放入50ml棕色滴瓶內，搖動10分鍾，使醋酸鈾充分溶解，最後仍會有一些醋酸鈾不溶解，說明已成飽和溶液，靜置1～2天後取上清液使用。 檸檬酸鉛染液 硝酸鉛［Pb(NO3)］ 檸檬酸鈉［Na3(C6H5O7)•2H2O］ 或Na3(C6H5O7)•5H2O 蒸餾水133g176g208g30ml 將上述藥品和餾水放入50ml容量瓶內，用力搖動1分鍾後，間隔搖動數次，30分鍾後可見溶液呈乳白色，加入1mol/L氫氧化鈉8ml，溶液變為無色透明後加餾水至50ml，搖勻，pH約為12，置冰箱密閉保存。 (2)染色方法：染色是在蠟盤上進行的，應製作兩套帶蓋蠟盤，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別使用。用直徑約為15cm的玻璃平皿，在皿蓋內鋪加一層熔化的石蠟，冷卻後形成光滑的平麵，作為染色蠟盤。染色時將飽和醋酸鈾滴在蠟盤上，有幾個載網就滴幾滴染液，把載網有切片的一麵向下漂浮在染液滴上，再將皿底倒扣在蠟盤上，室溫染15～30分鍾。用鑷子夾住載網邊在盛餾水的小杯中洗去多餘的鈾染液，用濾紙條吸幹。 將1N氫氧化鈉01ml用餾水稀釋成10ml，取2～4ml與檸檬酸鉛染液等量混合後滴在蠟盤上(如果檸檬酸鉛染液保存時間過長，可1000r/min離心5分鍾取上清液使用)，將已染醋酸鈾的載網切片麵向下漂浮在染液滴上，加蓋，室溫染色5～15分鍾。為防止空氣中的二氧化碳與鉛反應生成碳酸鉛沉澱汙染切片，可用1小玻皿盛適量氫氧化鈉放在蠟盤上，吸去空氣中的二氧化碳。染完後，相繼在盛餾水、002N氫氧化鈉溶液、餾水的三個玻瓶內洗去載網上的剩餘染液，用濾紙吸幹。 為了克服超薄切片的肓目性和電鏡視野的局限性，可在超薄切片前先用超薄切片機切一張05～2μm厚的半薄切片，染色後用光學顯微鏡選擇做超薄切片的適當部位。同時，這也是研究細胞之間關係的手段之一。 製作半薄切片時，先行削去包埋塊組織周圍的包埋劑，使塊表麵成一直角梯形，在超薄切片機上手動粗進刀旋鈕切取05～2μm厚的切片，用鑷子將切片轉移到幹淨載玻片上(玻片上可預先塗一薄層蛋白甘油，使切片不易脫落)。用下述任何一種方法染色後光學顯微鏡檢查。 ①天青美蘭染色 染色時將1％天青Ⅱ水溶液、1％美藍溶液(用1％硼砂水溶液配製)等量混合，滴在切片上，電熱板上加溫3～5分鍾，用水衝去染液。 ②甲胺藍染色 染色時將1ml1%苯甲胺藍溶液和20ml25%碳酸鈉溶液混合，滴在切片上，45～50℃染色10～20分鍾，用水衝去染液。 ③姬姆薩染色 染色時將姬姆薩原液1∶9稀釋，滴一滴稀釋液於切片上，在酒精燈上加溫染色數秒鍾(勿煮沸)後，用濾紙吸去染液。
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