一、菌種保存培養基
[配法]
蛋白腖10g,牛肉膏5g,氯化鈉3g,磷酸氫二鈉2g,瓊脂粉4.5g,蒸餾水1L 。
將上述的成分混合於水中,加熱溶解,調pH至7.4~7.6,分裝試管2/3左右高度,121℃高壓滅菌15min,成為半固體培養基,備用。
[質量控製]
培養基呈淡黃色半固體狀。大腸埃希菌(ATCC 25922)生長良好,動力陽性;福氏誌賀菌(ATCC 12022)生長良好,動力陰性;金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)生長良好,動力陰性。
二、增菌培養基
1.葡萄糖肉湯
[用途]
用於血液增菌。
[配法]
蛋白腖(或月示 腖)10g,氯化鈉5g,肉浸液(或心浸液)1L,葡萄糖3g,枸櫞酸鈉3g,5g/L對氨基苯甲酸水溶液10ml,1mol/L硫酸鎂溶液20ml,青黴素酶1000 U。
將蛋白腖、氯化鈉混合於肉浸液中加熱溶解,再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對氨苯甲酸及硫酸鎂,繼續煮沸5min,並補足失水,調整pH至7.8。
過濾分裝,每瓶50ml,高壓滅菌115℃20min後,每瓶加入青黴素酶50 U,經無菌試驗合格後,冷卻備用。
[用法]
將采取的血液標本,以無菌手續注入培養瓶中(血液1ml,培養液10ml),置35℃培養箱內,每天1次取出觀察結果。如有細菌生長,可出現數種不同的表現,應隨時作分離培養,可選用血瓊脂、伊紅美藍瓊脂及巧克力瓊脂平板等。無細菌生長表現的培養瓶,需連續觀察7d,仍無細菌生長方可棄去。在觀察的過程中,至少應作兩次分離培養。
注:
⑴ 枸櫞酸鈉為抗凝劑,可使血液加入培養基中不凝固。
⑵ 對氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。
⑶ 硫酸鎂主要抑製血液中存在的四環素、金黴素、新黴素、多粘菌素及鏈黴素的抑菌作用。
⑷ 本培養基近年來有許多改良配方,如加入0.3%~0.5%酵母浸膏以增加營養;加0.2%核酸刺激細菌生長;加0.1%粘液素能被覆於細菌的表麵,保護細菌免受抗體破壞;加入聚茴香腦磺酸鈉(SPS)能中和補體的抗藥作用從而提高檢出率。
2.血液增菌培養基
[用途]
血液和骨髓液病原菌的增菌培養。
[配法]
蛋白腖10g,氯化鈉5g,牛肉膏3g,葡萄糖1g,酵母膏粉3g,枸櫞酸鈉3g,磷酸氫二鉀2g,5g/L對氨基苯甲酸溶液5ml,1mol/L硫酸鎂溶液20ml, 4g/L酚紅溶液6ml,青黴素酶50 U,聚茴香腦磺酸鈉(SPS) 0.3g,蒸餾水1L。
將上述成分(除酚紅指示劑、青黴素酶外)混合加熱溶解,校正pH至7.4,再加酚紅,過濾分裝每瓶30~50ml,經121℃滅菌15min和35℃24h無菌試驗備用。臨用時每瓶加入1.5~2.5 U青黴素酶。
[質量控製]
傷寒沙門菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化膿性鏈球菌ATCC 19615、肺炎鏈球菌ATCC 6305、金黃色葡萄菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853均生長良好。
3.亞硒酸鹽增菌培養基
[用途]
沙門菌增菌培養。
[配法]
蛋白腖5g,乳糖4g,磷酸氫二鈉4.5g,磷酸二氫鈉5.5g,亞硒酸氫鈉4g,蒸餾水1L。
先將亞硒酸鹽加到200ml蒸餾水中,充分搖勻溶解。其它成分稱量混合,加入蒸餾水800ml,加熱溶解,待冷卻後兩液混合,充分搖勻,校正pH 7.0~7.1(通過調整磷酸鹽緩衝對的比例來校正pH值)。最後分裝於15×150mm的試管內,每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min,立即冷卻,置4℃冰箱保存備用。
[用法]
取新鮮標本1g或棉拭子采樣直接種於該培養管內。搖動後置35℃培養過夜。如發現均勻混濁,管底有紅色沉澱物,表示細菌生長。然後取培養物分離在選擇性培養基上,如SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板等,進行培養。
[質量控製]
培養基應呈淡黃色或無色,透明無沉澱物。增菌靈敏度:傷寒沙門菌1×10-5,鼠傷寒及副傷寒沙門菌1×10-7。
[保存]
4℃保存,1周內用完。
注:
⑴ 亞硒酸鹽,包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉均可使用,但以亞硒酸氫鈉效果為好。
⑵ 磷酸鹽緩衝對中,兩者的用量比例與亞硒酸鹽及蛋白腖的品種有關。製備前應進行調試,其總量為10g/L。
⑶ 在製備過程中,亞硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時間亦不能超過規定時間,否則亞硒酸鹽會變質,生成紅色沉澱物。
4.SS增菌液
[用途]
用於沙門、誌賀菌的增菌。
[配法]
月示 腖 2g,蛋白腖8g,牛肉膏3.5g,酵母膏2g,葡萄糖2g,枸櫞酸鐵10g,硫代硫酸鈉10g,亞硫酸鈉0.7g,膽鹽5.5g,磷酸氫二鈉4g,磷酸二氫鉀0.1g,去氧膽酸鈉(進口) 1.5g,煌綠0.005g,蒸餾水1L。
將上述成分加熱溶於水中,調pH至7.1,分裝試管(15×150mm),每管5~7ml,隔水煮沸5min備用。
[用法]
取糞便標本1g直接種於增菌液內,35℃16~18h培養,取出轉種於分離培養基即可。
[質量控製]
培養基應呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC 50096、福氏誌賀菌ATCC 12022 生長良好;大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑製。
注:
⑴ 切勿高壓,隔水煮沸時間不超過5min。
⑵ 煌綠用量應根據不同產品批號酌情增減。
5.堿性蛋白腖水
[用途]
霍亂弧菌增菌培養。
[配法]
蛋白腖 20g,氯化鈉5g,蒸餾水100ml。
將上述成分溶解於水中,校正pH 至8.6,分裝於試管8~10ml,經121℃滅菌15min備用。
[用法]
將待檢標本接種到堿性腖水中,置35℃培養6~8h,霍亂弧菌呈均勻混濁生長,表麵有菌膜出現。取表麵菌液一白金環移種到堿性瓊脂、慶大瓊脂或TCBS瓊脂平板上。必要時做第二次增菌。
[質量控製]
有條件的實驗室可用標準菌株,一般臨床實驗室可用非01群弧菌,培養後生長良好者方可使用。霍亂弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生長良好(6h);大腸埃希菌ATCC 25922不生長(6h)。
[保存]
置4℃冰箱,2周內用完。
注:若在每升堿性腖水中加入1%亞碲酸鉀溶液0.5~1.0 ml,則成為亞碲酸鉀堿性腖水,其增菌效果更為理想。
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