生物大分子電鏡樣品的製備　

  生物大分子主要包括蛋白質、核酸、多糖和脂類。這些物質在生命活動中起著重要作用，所以研究它們的大小、形態、空間結構以及各種存在形式，對了解其功能和在整個生命過程中的變化都具有重要意義。通常研究生命大分子多用兩種方法：一是用物理和化學方法測定其理化特性；二是用電鏡和X射線衍射技術觀察分析其形態及空間結構。X射線衍射技術在蛋白質結構研究方麵雖然分辨率高達01nm，但隻適用於能形成結晶體的樣品，局限性較大。而電鏡觀察的方法則比較簡便，結果直觀可靠。雙鏈核酸分子01nm長度的平均質量為196左右，如果DNA的分子量為2×106Da，則其分子長度可達1002nm，即1μm左右。由此看來，應用電鏡技術觀察和研究生物大分子結構不論其分辨率還是放大倍數完全可以達到目的和要求，當然這與樣品製備有著密切關係。目前，應用電鏡技術研究最多的是蛋白質和核酸兩大類，其製樣方法如下。　　 1.蛋白質分子的電鏡樣品製備　　由於蛋白質樣品的電子散射能力很低，極易聚合成堆，所以製樣時必須設法增強其反差和進行分散處理。蛋白質分子從形態上可大致分為纖維狀和球狀兩大類。纖維狀蛋白是由沿一個單軸平行排列的多肽鏈所組成，形成長纖維或薄片，其性質強韌、不溶於水，如動物的膠原、角蛋白、彈性蛋白等；球狀蛋白的多肽鏈呈盤曲折疊，許多較大的蛋白質都有二條或多條肽鏈，形成複雜的三級、四級結構。球狀蛋白多數溶於水，能結晶，如酶類、血紅蛋白、抗體等。還有些蛋白質則與其它組分結合成複合體，如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白(病毒)等。根據不同蛋白質和不同的研究目的，所用的製備方法也不同，其製樣方法有負染、擬複型、金屬投影和超薄切片法等。　　(1)負染色法：負染色是製備蛋白質電鏡樣品最常用的方法，既適於遊離狀態的單個分子，又適於蛋白質結晶體。其製樣過程與常規負染法相同，但應注意以下幾點：①采用低噪音的碳膜，因為蛋白質分子通常都很小，利用常規的有機膜在負染後會出現一些假象結構，容易造成誤判，因此最好采用低噪音的純碳膜，碳膜厚度以10～15nm為宜。②分離蛋白質的溶液應有適當的濃度、離子強度和pH值，其濃度以5～10μg/ml為宜。如果濃度太低，觀察時難以尋找。濃度太高又易堆集，難以看清單個分子的結構。所用緩衝液濃度一般不超過2mmol/L，高濃度的鹽離子會在銅網膜上形成結晶，影響電鏡觀察。③負染色劑應選用具有較大惰性的、不會引起蛋白質結構產生變化的試劑。常用的有磷鎢酸、鉬酸銨、矽鎢酸等。醋酸鈾也可用，但pH值大於6時就會發生沉澱④負染色操作，常用懸滴法或噴霧法。滴附後，載網需用雙蒸水進行多次醮洗，洗去樣品中的鹽類及雜質，然後再進行負染色。使用碳膜時，因為蛋白質樣品不能均勻地吸附，必須先將碳膜用輝光放電裝置或靜電荷發生器或直接放在離子濺射儀中處理，使碳膜表麵帶上一定量的靜電荷。有時將染液和樣品混合後再粘樣，往往也能使蛋白質樣品較好地分散在支持膜上。應用噴霧方法時，將蛋白質樣品和染液先混合，為了避免混合後蛋白質溶液發生沉澱，要求染液的pH值不能接近蛋白質的等電點。　　(2)雲母擬複型法：利用噴霧法及新鮮剝開的雲母片表麵的強親水性，可以解決蛋白質分子分散難的問題。但該法通常隻能觀察分子的外形及大小，難以看到內部結構，分辨率也較低，但對一些纖維狀蛋白質分子還是很有用的。具體製樣方法見本章的“金屬投影和複型”節。　　(3)金屬投影法：　金屬投影法不僅能增強蛋白質晶體的反差，而且能增加樣品表麵的導電性，以便用電子衍射技術對晶體進行分析研究。具體製樣方法按常規法進行。　　(4)超薄切片法：超薄切片法用於研究蛋白質晶體樣品。對於一些體積較大，而且晶形較完整的結晶體，可以根據結晶學的規則來選擇特定的方向進行切片，以便得到有關的結晶學參數。製樣按常規法進行。如果結晶體很小，切片不易定向，也可通過分析許多隨機定向的切片之間的內在關係，來判定晶體的方向，推算出結晶學參數。例如，昆蟲多角體病毒的包涵體是一種蛋白質結晶體，通過超薄切片能了解它的晶格形式、取向和間距等資料。　　電鏡觀察的要求：①電鏡要有較高的分辨率，觀察蛋白質分子樣品，需要把電鏡調至最佳狀態，精確合軸和消像散，準確調焦，消除樣品飄移等因素；②要盡可能減少輻射損傷，因為蛋白質分子對電子束較敏感，長時間的電子束照射，對樣品會產生損傷和汙染，掩蓋微細結構。為此可采用如下措施：a.用“冷境”來冷卻樣品，並使用較小的束電流；b.選擇視野要迅速。調焦時，先對準近旁區域，調焦後再將需要的部位移到中央進行照像；c.現代高性能電鏡上有最低輻射裝置(MDS)，以減小調焦時帶來的輻射損傷；d.還有的使用低溫樣品台、低束流，配合圖像增強器，將掃描透射電鏡(STEM)運用於大分子的觀察等。 　　2.核酸分子的電鏡樣品製備根據核酸的結構和功能可分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA大都是長鏈狀的雙螺旋分子(有部分病毒如細小病毒為單鏈DNA)，直徑為2nm。通常雙螺旋分子再進一步盤繞折疊形成三級或四級結構；RNA大都是單鏈分子(呼腸孤病毒及雙鏈RNA病毒為雙鏈RNA)通過分子內堿基配對，形成“三葉草”狀的二級或三級結構。應用電鏡技術不僅可以觀察核酸分子的形狀和長短，還可以區分是雙鏈還是單鏈，計算出分子量；通過一些特殊方法，還能分析異源雙鏈分子、雜交分子、轉錄複合體、核蛋白複合體等(如圖12-17)。從而為研究核酸的複製、轉錄，了解基因組的結構、基因片段的缺失、插入或倒置、基因定位以及堿基組成特征等，提供重要資料。　　用電子顯微鏡直接觀察核酸大分子，製樣技術上的關鍵問題是如何克服反差弱和保持核酸分子在溶液中的構型。長期以來主要采用蛋白質單分子層技術，其中以Kleinschmidt方法應用較廣。此法利用球狀堿性蛋白在水溶液(或鹽溶液)表麵形成不溶的變性薄膜。當蛋白溶液中含有核酸分子時(上相液)，帶有負離子的核酸分子被帶正離子的蛋白質分子所包圍，蛋白質在水溶液或鹽溶液(下相液)表麵展開成膜狀單分子層時，核酸分子也同時伸展成細絲狀的形態。  圖12-17 克隆的牛乳多空病毒核酸(橫杠=25nm)P表示質粒區域，V表示病毒核酸區域，小箭頭指示處為單鏈區域，大箭頭指示處為異源雙鏈分子        ——自Campo等 　(1)細胞包素C法：細胞色素C是最常用於這一目的的蛋白質，以斜麵法或微量法使其展開成單分子膜。　　上相液 4mmol/LEDTA(pH75)125μl；24mol/LNH4Ac125μl。二者混勻後，加入25μlDNA溶液(DNA終濃度為05～10μg/ml)。混勻後，取出5μl，後加入5μl細胞色素C(1mg/ml)。　　下相液 005mol/LNH4Ac。　①斜麵法 以直徑為10～15cm的幹淨平皿或塑料盤，充滿下相液後，將幹淨載玻片以30度角斜放在平皿中，溶液表麵灑少量滑石粉，以觀察樣品展開的區域。用微量注射器吸取上相液10～15μl沿玻片斜麵滴入，上相液便沿玻璃斜麵流下，推開滑石粉在下相液上展開成蛋白質單分子層。約經30秒鍾後，以覆膜的載網撈取樣品，然後以不同濃度的乙醇(25％、70％、99％)脫水或自然幹燥。一般用鉑銥合金在7度角以20～30r/min旋轉噴鍍後，電鏡觀察。如果先用醋酸鈾酒精溶液(濃度為10-3～10-5　mol/L)染色30秒後再噴鍍，效果更好。　　②微量法 將下相液4～5滴滴在聚四氟乙烯板上，然後用微量注射器在液滴表麵輕輕加上相液5μl，靠液滴的表麵張力將樣品展開在水滴表麵，經2～3分鍾後，用覆膜載網撈膜，用不同濃度的乙醇(25％、70％、99％)脫水或自然幹燥。一般用鉑銥合金在7度角旋轉噴鍍後電鏡觀察。　　溶液中的核酸分子隨溶劑、溫度與pH的不同，其所呈現的分子形態也有差異。在核酸結構中的各種化學鍵,受以上條件改變時影響最大的是各堿基之間相連的氫鍵。一般DNA總是以規則的雙螺旋結構形式存在。兩鏈中的堿基皆按AT與GC的關係配對。它們各自之間皆以氫鍵相連。因此DNA分子有一定的剛性，用上述方法製備DNA樣品容易獲得原有的結構圖象。　　(2)甲酰胺法：由於RNA是單鏈分子，單鏈內的堿基常可相互形成氫鍵而使分子聚集，在電鏡下成團出現，無法分清其真實的構型及變化。Davis(1971)在溶液中加入一定量的甲酰胺，解開氫鍵，使RNA分子或DNA分子展開成鏈的形態。展開方法也是斜麵法和微量法(如上所述)。　　上相液 40％甲酰胺中含05～10μg/mlDNA，005μg/ml細胞色素C，01mol/LTris，10mmol/LEDTA，pH85。配好後1小時內使用。　　下相液 30％甲酰胺中含10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH85。用前現配。　　　　(3)甲胺鹽法：在用電鏡研究核酸與蛋白質的相互作用時，為了排除細胞色素C這一類蛋白質在觀察時產生的幹擾，可用季銨鹽中的溴代十六浣基三甲胺(C16H33N＋Br-)或溴代十八烷基三甲胺(C18H37N＋Br-)代替細胞色素C，使核酸分子展開。甲胺鹽類的價格隻是細胞色素C的1％左右。　　上相液 核酸分子濃度為1μg/ml，溴代十六(或十八)烷基三甲胺濃度為005mg/ml，甲酰胺濃度為492％，用02mol/LTris和29mmol/LEDTA作緩衝液調pH至85。下相液 無離子水。　　用直徑90mm的塗蠟玻璃平皿，倒入下相液後撒上少量滑石粉，用洗淨的載玻片以20度左右的傾斜角放在平皿上，用微量注射器吸4μl上相液滴在載玻片上，流至水麵上即展開成單分子膜，吸附在覆膜載網上，經脫水或自然幹燥後，用鉑銥合金旋轉噴鍍。

 

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