1.離子交換捕捉
離子交換捕捉(ionexchangecapture)技術是一種純化病毒的技術，常用於從糞便樣品中純化病毒。其原理至今不太明了，一般認為是通過磷酸氫鈣(CaHPO4)的靜電引力將懸浮樣品中的蛋白質顆粒吸附下來，再用溶解劑EDTA將CaHPO4溶解，使蛋白質顆粒遊離下來。其具體方法如下：(1)試劑的製備：①CaHPO4的製備 將03mol/L氯化鈣(111gCaCl2•H2O溶解在200ml蒸餾水中)和03mol/L磷酸氫二鈉(142gNa2HPO4溶解在200ml蒸餾水中)，以相同流速(120滴/分鍾)分別從兩個容器中流入一個盛有100ml蒸餾水的燒杯裏，同時用磁力攪拌器攪拌。將粗製的CaHPO4(呈絮狀沉澱)再反複4次以蒸餾水懸浮和沉澱，最後將沉澱的CaHPO4用015mol/LPBS(pH72)懸浮，保存於4℃中待用。②EDTA飽和液配製 將98gEDTA加到100ml蒸餾水中，強烈振蕩，溶解後，調pH到72，置於4℃中備用。 (2)糞樣處理：將采自腹瀉動物的糞便，製成10～20％懸液，以1500r/min速率，離心10分鍾，取其上清液約1ml，加CaHPO42滴，充分攪勻，以同樣速率離心，棄上清，向沉澱中再加2滴EDTA飽合液，使CaHPO4溶解。(3)負染色：將處理後的糞便滴附在碳福爾馬林膜上，用2％PTA負染後電鏡觀察。 經對比試驗表明，此法製備樣品的純度相當於超速離心法。電鏡觀察結果表明，圖像背景清晰，雜質少，病毒數量增多，適用於臨床檢驗各類病毒的快速診斷。
2.高速離心
為了提高樣品的含病毒量，一般采取超速離心沉澱法來實現，但此法要求超離設備，也很麻煩。經我們摸索，對於組織培養的細胞培養物或懸浮樣品(包括腹瀉糞便、尿液、痰、腦脊髓液、血清、水泡液、粘膜分泌物、雞胚尿囊液、羊水等)，采用台式高速離心機，即能達到檢測病毒的目的。其方法：①用吹打、超聲波或凍融法等將樣品中的病毒充分釋放出來；②低速離心，以3000r/min速率離心15～20分鍾，將大的組織物沉澱下來，取上清；③以15000r/min速率離心20分鍾，取沉澱物；④用1滴蒸餾水懸浮；⑤2％PTA負染色；⑥電鏡觀察。
3.液相免疫電鏡
液相免疫電鏡(liquidphaseimmunoelectronmicroscopy)，亦即常規的抗原抗體免疫複合物法。就是抗原和相應的抗體特異性結合，形成大分子複合物或聚合物，易於沉澱，便於電鏡觀察。此法最常用，且簡便易行。通常將一定量抗原(01～025ml)與等量稀釋後的抗體混合，37℃作用1小時，高速離心，取其沉澱物，經少許緩衝液懸浮，負染後，即刻觀察。本法中值得注意的是：①抗原與抗體的合適比例是關鍵，因為抗原或抗體過量或不足都不易形成理想的便於觀察的大塊複合物。為此，常用瓊脂免疫擴散試驗，預先找出抗原、抗體合適比例；②高速離心法可用瓊脂凝膠擴散濾過法代替。方法如下：a.將濾紙疊成4～6層，一般為半個載玻片大小，用釘書機將兩端平整地釘在一起，浸泡於飽和聚乙二醇(30g聚乙二醇溶於100ml水中)內約數分鍾，取出後，置幹燥器內防潮備用；b.製備1％瓊脂糖板，將瓊脂糖以pH72巴比妥緩衝液或生理鹽水加熱溶化，取約15ml鋪於普通玻片上，冷凝後置於潮濕盒內並放在4℃備用；c.以刀片切取小塊瓊脂糖板，鋪於聚乙二醇濾紙墊上，取1滴抗原抗體複合物懸浮液滴附在瓊脂糖板上，當複合物懸液還未被全部吸收完時，用載網，膜麵朝下浮於複合物液滴上，取下載網，經負染後電鏡觀察。此法快速、敏感度高，常用於快速診斷病毒病(圖12-20)。 圖12-20 貉細小病毒的液相免疫電鏡圖像 注意抗體橋連接的病毒粒子(箭頭)，比例尺為100nm。
.固相免疫電鏡
固相免疫電鏡技術(solidphaseimmunoelectronmicroscopy)是將抗體固定在固相載體上，在懸浮樣品中捕捉相應的抗原(病毒粒子)，以便在電鏡下觀察鑒定。此法優點在於圖像背景較清晰，較好地除去非特異性雜質，使病毒粒子容易觀察。尤其近年，將金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)應用在固相免疫電鏡技術後，克服了抗血清(抗體)直接鋪蓋銅網膜的缺點，即使應用效價較低的抗血清，也可得出較好的效果。1979年，Shukla等首先將SPA應用於電鏡檢測植物病毒。以後Nicolaieff等又將其應用於輪狀病毒的電鏡檢測。 現以檢測豬輪狀病毒為例，介紹固相免疫電鏡檢測的具體方法：一種方法是直接利用金黃色葡萄球菌菌體做固相載體。水浴加熱80℃約5分鍾，處理該菌使其充分暴露細胞壁上的SPA，利用它具有吸附某些動物血清中IgG的特性，使該菌表麵包被一層特異性抗體。在懸浮的樣品中，它就像滾雪球一樣，粘附相應的抗原(病毒粒子)，便於電鏡觀察。該法從製樣到觀察，整個過程隻需2小時左右，其操作步驟為：①取兔抗豬輪狀病毒高免血清(抗體)用01mol/LPBS(含002％疊氮鈉pH72)稀釋10倍，與金黃色葡萄球菌菌體(每毫升含3×108個)等量混合並將混合液置於37℃水浴中孵育15分鍾；②取1ml混合液，以3000r/min速率離心15分鍾，棄上清，將沉澱物用PBS液懸浮，按同法離心2次,以除去未結合的抗體；③用1ml含病毒糞樣將帶有抗體的葡萄球菌再次懸浮，置於37℃水浴中，輕微振蕩感作30分鍾；④按上法離心2分鍾，棄上清，用01mlPBS液將沉澱懸浮，並滴附在蠟盤上，用05～10％磷鎢酸水溶液負染05～1分鍾後，電鏡觀察。 另一種方法是利用銅網上的膜作固相載體，通過SPA將特異性抗體固定在銅網膜上。具體操作步驟為：①滴10μlSPA(01mg～05mg/ml)於蠟盤上,將銅網膜麵向下漂浮在SPA液滴上,約1分鍾；②用濾紙吸去多餘的SPA；③將10μl稀釋好的(1∶10倍)兔抗豬輪狀病毒血清滴於蠟盤上，再將附有SPA的銅網膜麵向下漂浮在血清液滴上，約1分鍾；④用同樣的液滴漂浮法，在蒸餾水液滴上漂浮5次，洗去抗血清中未被SPA吸附的雜質；⑤將20μl含病毒糞樣滴附在蠟盤上，再將吸附抗血清的銅網膜麵向下漂浮在含病毒的糞樣滴上，置37℃溫箱中約30分鍾；⑥水洗10次，分別在PBS液滴上漂浮5次，在蒸餾水上漂浮5次；⑦負染，用2％磷鎢酸染1分鍾左右，電鏡觀察。 在固相免疫電鏡操作中，作者認為下列問題值得注意：①在以金黃色葡萄球菌菌體為固相載體時，要選擇含SPA豐富的菌體，此點對試驗成功與否是個關鍵；②金萄球菌與抗血清感作後，要盡量將過剩的遊離抗血清，通過反複懸浮和離心除掉，以免影響葡萄球菌對病毒的捕捉；③包被抗體的葡萄球菌與病毒粒子相作用時，要充分攪拌，使二者有足夠的相互作用機會；④負染葡萄球菌時，染液濃度要低，防止濃染，否則會影響吸附在葡萄球菌周圍的病毒粒子的觀察；⑤第二種方法中的SPA濃度，試驗證明以01mg/ml的效果最好，濃度太高會影響吸附效果；⑥兩種方法中所用的抗血清都應56℃30分鍾滅活，以消除非特異性反應物質(圖12-21，12-22)。 圖12-21 在金黃色葡萄球菌的表麵吸附許多豬輪狀病毒粒子(箭頭)
比例尺為100nm
