臨床常用電鏡技術（二）

　懸浮樣品的免疫金標記法，容易產生非特異性反應，這主要是抗原、抗體以及膠體金抗體比例不合適的緣故。作者在實驗中發現，應用高速離心法除去過量的抗原或抗體或膠體金抗體，不僅有助於除去非特異性反應，而且不會降低敏感性。其具體操作步驟：①取抗原(病毒液)50μl和相應的抗體(高免血清)50μl混合均勻；②置於37℃溫箱中作用1小時，加蒸餾水至滿管，以10000r/min速率離心30分鍾，棄上清；③將沉澱物用蒸餾水100μl懸浮；④加50μl葡萄球菌A蛋白或第二抗體包被的膠體金溶液，混合均勻；⑤置於37℃溫箱中作用30分鍾；⑥加蒸餾水至滿管並以同樣速率和時間離心；⑦棄上清，取其沉澱物，用100μl蒸餾水將其懸浮，負染後電鏡觀察(圖12-23)。[HT5”SS] 圖12-23　免疫金標記的電鏡圖像(比例尺為100nm)　        豬輪狀病毒粒子(箭頭)           ——自李成等

6.快速包埋超薄切片　　

一般包埋方法需時較長，大致需2～3天，甚至長達1周左右，郝桂玉等建立了適於口岸動物檢疫和臨床快速診斷病毒病的快速包埋方法：①固定，4％戊二醛固定10分鍾，1/15mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)pH74衝洗數次，1％四氧化鋨固定10分鍾，PBS衝洗一次；②脫水，70％、95％、100％丙酮各5分鍾，內含無水硫酸鈉的100％丙酮換2次；③浸透，1份100％丙酮加1份包埋劑(Epon81270g、DDSA15g、MNA45g、DMP30按全量的2％加入)，在37℃溫箱中浸透10分鍾，純包埋劑混合物浸透10分鍾；④聚合包埋，用牙簽將樣品挑入膠囊或模具中，然後灌注適量包埋劑，置於95℃烤箱中，經1小時聚合，待冷卻後切片，2％醋酸鈾水溶液染色2分鍾，枸椽酸鉛染色5分鍾，即可電鏡觀察。

7.微波輻射製樣　　

微波輻射製樣方法是將生物樣品的固定、脫水、浸透、包埋、染色等操作均在微波爐中進行,予以一定“火力”和時間的微波輻射，從而加速製樣過程。　　(1)微波輻射製樣技術的原理:　　微波是一種非電離輻射的電磁波，其波長在1mm至1m之間，用頻率為2450MHz(兆赫茲)。生物樣品中的一些雙極分子，如H2O、有極性側鍵的蛋白分子以及電荷不均一的其它任何分子，一旦暴露於電磁波的照射下，這些分子以180度的角度以每秒2450MHz的高速進行轉動與震動，在短時間內組織內部便產生高熱，從而加速固定、包埋、染色，以及免疫反應、組化反應等的時間和提高製備質量，利用家用微波爐即可在兩小時內製備出高質量的包埋樣品供電鏡觀察。圖片的反差良好，精細度極高，染色沉澱很少。對包埋後的樣品進行免疫金標記，亦可大大加速反應。通常利用在微波爐四周加水的方法來調節微波爐內的溫度，以免爐溫度過高破壞組織內的抗原性。　　(2)微波輻射快速製樣技術的基本程序：現以國產蜆華牌家用微波爐為例來介紹。該儀器的功率為550W，並設有P1～P10共10個火力段。　　①取材 取新鮮材料，按超薄切片常規法進行；　　②固定 將樣品置於25％戊二醛中，放入微波爐，在P1火力段下輻射15秒鍾作前固定，用磷酸緩衝液衝洗樣品3次，再用1％鋨酸液浸泡並放入微波爐中，於P1火力段下經15秒鍾作後固定；　　③脫水 在室溫下放置60秒鍾，經磷酸緩衝液衝洗3次(每次3分鍾)，用50～100％係列丙酮逐級脫水，每級脫水均在P1火力段下輻射1分鍾左右；　　④浸透 先將樣品放入環氧丙烷中，在室溫下放置10分鍾，然後依次投入環氧丙烷與環氧樹脂1∶1和1∶2混合液中，在P1火力段下2分鍾；然後將樣品放入純環氧樹脂中，在P1火力段下3分鍾；　　⑤包埋 將樣品置於配製好的包埋液中，並於周邊放一盛有300ml水的燒杯，在P1火力段下30分鍾，而後再移去周邊的燒杯，繼續在P1火力段下輻射30分鍾；　　⑥切片 與常規超薄切片法相同；　　⑦染色 鈾染色動植物組織切片最佳輻射時間均為30秒；鉛染色動物組織切片最佳輻射時間為30秒,而植物組織切片為20秒,染色液經微波輻射後的溫度應控製在20～40℃。　　(3)微波輻射製樣注意事項：　　①嚴格控製輻射溫度 微波輻射時固定液的溫度應控製在40～50℃之間為宜，否則易引起微波損傷，脫水時的溫度宜在20℃左右。為了掌握微波爐各功率段下各種溶液的不同溫度，最好在實驗前預先測定；　　②嚴格掌握輻射功率 製樣過程中每一步驟所使用的功率(火力段)不盡相同，但總的說應以小功率輻射為主，而且在需要長時間輻射時(如脫水、聚合和包埋)，最好采用低功率、間斷輻射的方式，這樣才能保存組織的超微結構；③在每步微波輻射之後，最好讓樣品在藥液中停留一段時間，以保證藥液滲入樣品並與組織充分結合；　　④微波爐的廠家及型號不同，其功率大小和火力段的功率分配亦不相同，故實驗時應根據選用的微波爐來確定每一步驟用的火力段與輻射時間。　　　　　　　　　

 8.免疫快速包埋超薄切片