電子顯微鏡技術的新發展

　　

  目前，用於生命科學研究的電子顯微學發展有兩個趨勢。一是向更微細的結構，生物分子和原子水平發展。電鏡已成為分子生物學、分子遺傳學非常重要的研究工具之一，用於細胞生物學、生物分子結構與功能關係以及抗原、抗體、蛋白質、DNA定位等研究，例如對微管分子的研究、膜抗原的超微定位、膜抗原基因對核及細胞骨架係統蛋白質組成的影響、細胞核內DNA、組蛋白、非組蛋白的分子觀察和定位以及核孔複合體識別蛋白質的觀察等等，都取得了非常突出的進展。另一個重要趨勢是向更普及的應用方向發展，如農林、醫藥、動植物學等。在應用方麵最引人注目的是病理診斷電子顯微學。它已成為一些病毒，如某些腫瘤和病毒病診斷上必不可少的工具。自從微波技術引入診斷電鏡學以後，病理樣品從取材到電鏡觀察隻需2小時左右；免疫電鏡、電鏡組化等技術均已引入常規診斷學中。　

　 1.掃描電鏡向高分辨率與低電壓方向發展。日本人Tanaka改進了常規的掃描電鏡，設計了新型超高分辨率掃描電鏡UHST1型，係統地改良了生物樣品的製備技術，關鍵是免除了金屬噴鍍的基本製樣過程，而用小而薄的樣品，使用“導電染色”，如用醋酸鈾水溶液浸染，以逐級乙醇脫水，在臨界點幹燥，以“拋光的碳平板”(polishedcarbonplate)作為樣品的載體，在電壓15KV條件下可以獲得超高分辨的掃描電鏡圖像，達到優於08nm的分辨力。不僅可以分辨出核糖體的大、小亞基，並可見到串連於諸多核糖體之間的mRNA的纖細絲狀結構，能看見DNA分子雙螺旋結構及其大溝與小溝。這一進展令人鼓舞，它使生物大分子的三維圖像直接展現在人們眼前。　

　 2.電鏡水平的原位核酸雜交為了提高核酸雜交的準確性與分辨力，不使用同位素放射自顯影技術而使用膠體金標記技術。電鏡原位雜交技術雖然早在1971年就開始有報道，隨後不少科學家也進行了許多嚐試，但都存在一個共同問題，就是樣品精細結構保存的不好。直到1986年Binder等人用LowicrylK4M包埋樣品，切片後進行雜交，才改進和提高了雜交的效率和結構的保存。1987年Webster等用與Binder相似的方法檢測了細胞內mRNA的分布。Singer等則於1989年用雙標記原位雜交技術同時檢測細胞內與骨架結合的mRNA及其所表達的蛋白質。　　Erickson使用鏈親和素金標記物，以生物素標記cDNA為探針，多聚甲醛固定樣品1小時，以二甲基甲酰胺脫水，用LowicrylK4M樹脂包埋，在鎳網上進行染色免疫反應。　　

 3.高壓電鏡高壓電鏡主要用於兩個方麵。一是由於高壓電鏡對薄樣品的輻射損傷小，因而可以獲得薄樣品的高分辨像；二是由於高壓電鏡的穿透力強，可以觀察厚樣品和含水樣品(如活體微生物和病毒等)。厚樣品如單層細胞，經固定、染色和臨界點幹燥後，結合立體觀察可研究完整細胞的三維結構及其與功能的關係，已有不少學者進行了這方麵的研究，並取得了一定進展。含水樣品是放在高壓電鏡特製的充氣小室內進行觀察的，雖已有人進行了這方麵的探索，但尚有不少技術問題有待解決。　　

 4.X射線顯微分析X射線顯微分析(Xraymicroanalysis)是在電鏡基礎上發展起來的一項新技術。該技術特點在於：①既用電鏡觀察樣品的超微結構，又能分析其微小區域內的化學元素，為研究樣品的形態結構、組成成分與其生理功能的關係提供了條件；②可以分析小於1μm樣品中的元素，其靈敏度可高達10-15～10-18g，這是其它分析方法難以實現的。該技術所用儀器包括分析型電鏡、透射電鏡、掃描電鏡、掃描透射電鏡加X射線顯微分析裝置以及專門設計的電子探針等。它的原理是在電鏡內先以高速細電子束轟擊樣品表麵的微小區域，使該區域所含元素各自發射出特征X射線，同時利用波譜儀(WDX)和能譜儀(EDX)查出特征X射線的波長和能量，據此可以了解該區域內元素的種類和含量。　　X射線顯微分析生物樣品的製備最好運用冷凍製樣法。樣品經液氮和低溫凍結後，可以保存細胞內的各種可溶性物質和電解質，有利於進行細胞生理及生化功能的研究。冷凍製樣技術包括冷凍幹燥、冷凍置換及冷凍超薄切片等。　　

 5.電鏡細胞化學是將細胞化學和電鏡技術相結合的一項技術，是光學顯微鏡組織化學基礎上的延伸與發展。該技術是將特定反應產物形成電子散射力強的不溶性沉澱物，借助電鏡做超微結構的原位分析。由於細胞內酶分布和細胞超微結構二者密切結合，從而為探討細胞的生理和病理狀態提供了科學依據。此法無需對酶進行提取和分離，就能獲得組織或細胞內有關代謝的大量信息，因此能將超微結構與功能反應有機地結合起來。目前，用該技術檢出的酶大約有80種，近40種可進行超微結構定位。酶的電鏡細胞化學技術大致操作步驟為：化學固定或冷凍切片、溫育、鋨化、脫水、樹脂包埋、超薄切片、電子染色、電鏡觀察等。　　

 6.掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡(scanningTunnelingMicroscopy,STM)是近幾年才發展起來的一種新型顯微鏡。STM利用量子力學中的隧道效應原理，可在原子尺度下研究物體表麵的微觀結構和電子態。1983年首次用STM得到了Si(111)7×7重構表麵的原子分辨圖像，為認識這個在表麵物理中可能是最令人感興趣而又最複雜的表麵奠定了基礎。STM不僅用於獲得原子結構和電子態等對基礎研究十分重要的信息，且已顯露出在微電子工業、表麵微加工、電化學、催化、分子生物學工程等許多領域中的應用前景。據不完全統計，全世界已有千餘台STM。　　STM的基本工作原理是讓一個有效尖端是原子尺度的針尖在壓電陶瓷管的驅動下，由反饋回路控製在被研究物表麵上方零點幾納米處掃描，以獲得表麵信息。另外，由於隧道電流與針尖至樣品的距離是指數關係，它對針尖至樣品的距離改變極其靈敏(通常距離變化01nm，電流改變一個數量級)。這使得STM同時具有表麵結構的實空間顯示特性和原子尺度的高分辨本領。目前橫向分辨本領可達01～02nm，深度分辨本領達001nm，放大倍數可達數千萬倍。並且能直接給出三維圖像。　　STM由於成像原理不同於透射電鏡，因而也突破了樣品必須處於真空中的限製。它既可在真空中工作，也可在大氣中甚至在液體環境中工作，這個特點特別有利於生物材料的研究，能夠克服生物樣品在真空中因脫水而產生的形變。此外，在STM中沒有高能電子束對樣品的作用，對樣品表麵沒有破壞作用，從而避免了透射電鏡中高能電子對樣品的輻射和熱損傷。生物樣品，特別是生物大分子，極易受高能電子輻射的損傷，這種輻射損傷已成為透射電鏡研究生物大分子結構的頭等問題。STM由於不需要任何光學透鏡和電子透鏡，體積小巧玲瓏，而又具有強大功能，所以獲得了口袋顯微鏡的美稱。　　1983年以來，已經報道的用STM研究的生物Φ29噬菌體、生物膜、細菌細胞壁和DNA等。　　DNA是生命遺傳信息的載體，研究其形態結構對分子生物學具有重大意義。同時，DNA具有結構上的均一性與恒定性，在形態上易於識別，這在一定程度上避免了STM觀察視野小(一般最大是幾微米)的內稟不足。盡管DNA的導電機製還不十分清楚，國外還是有一些實驗室用STM對DNA做了研究，並得到了令人振奮的結果。