被觀察物大小的測定和電鏡放大倍數的校準

　放大倍數除以物像(mm)，就是被觀察物體的實際大小。病毒或其亞單位等習慣上常用nm作為計量單位，用下式計算較為方便： 　　　　　　　物體(nm)＝ 像(nm) 總放大倍數 ×106　　如果像(mm)是在熒光屏或底板上測得的值，則總放大倍數就是電鏡的電子放大倍數；如果像(mm)是在照片上測得的值，則總放大倍數就是電子放大倍數和光學放大倍數的積。　　在進行新病毒的分類鑒定時，希望知道病毒或其亞單位較為準確的大小數值。由上式可見，要想得到被觀察物比較準確的大小，電鏡的放大倍數必須準確。我們知道，現代電鏡的放大倍數大多是由電鏡製造廠提供的放大倍數曲線表上求得的，有些電鏡則用數碼管直接顯示放大倍數，但是廠方提供的放大倍數，往往與電鏡的實際放大倍數有較大的誤差，有時高達10％。這是因為電鏡在使用一段時間後，與放大倍數有關的某些數值會發生改變，主要是：　　(1)加速電壓的改變：加速電壓下降，放大倍數上升；反之，加速電壓上升，則放大倍數下降。　　(2)樣品相對於物鏡距離的改變：樣品相對於物鏡距離的變化，如載網的樣品麵向上或向下、載網彎曲、樣品杯相對樣品台位置的改變等，可使放大倍數增加或減少。　　(3)成像透鏡的勵磁電流從低檔增加到某一數值和從高檔下降到同一數值時，由於磁滯效應可使放大倍數不同。　　因此，除進行正確的操作外，應隔一定時間對電鏡的放大倍數進行校準。　　校準的方法是用一已知大小的樣品作為標準物，電鏡放大標準物在底片或像片上測得的該標準樣品的大小與其實際大小之比，即為電鏡的放大倍數。因一般都是以毫米為單位測量標準物和像大小的，標準物多為光柵複型，用下式計算放大倍數比較方便： 　　放大倍數＝(底片或照片上)毫米數/光柵條數×(實際光柵)光柵條數/毫米　　電鏡放大倍數的變化範圍大，目前尚無理想的校準樣品。較為常用的校準樣品是方格光柵複型，每毫米含1000條左右到2000條以上不等，每毫米2000條以上的方格光柵複型可校準到約50000倍。校準前，先用光學相差顯微鏡精確測定光柵上方格的間距，計算出從原版光柵製備複型時產生的誤差。校準時，要測量像上的10條光柵線，並對不同視野取平均值，這樣才可達到較高的精確度。對於更高的倍數，可在光柵複型上選一個易於辨認的小物體(如髒物或刻痕等)，以光柵為準，測出小物體某二點間的距離，再以此為標準，逐步放大，進行校準。　　校準更高的放大倍數，需要應用具有一定周期結構的晶體。常用牛肝過氧化氫酶結晶校準高放大倍數，其晶格線間距為844nm。製樣需在室溫下進行，用細滴管吸取少量牛肝過氧化氫酶結晶滴於覆膜載網上，過剩的溶液用濾紙吸去，自然幹燥10分鍾左右，然後用pH70的2％磷鎢酸溶液負染1～2分鍾，濾紙吸幹後電鏡拍片。計算放大倍數同光柵複型法。更高放大倍數的校準可用晶麵間距為126nm的酞氰銅。