病毒粒子經過初步濃縮之後，要進一步純化，通常采用超速離心法，它是分離提純不同大小的病毒的有效方法之一。在應用超速離心法沉澱病毒時，必須了解所用離心機的離心力。離心機由於轉頭的回轉產生了強大的離心力，這種離心力是隨轉頭的大小和離心管至轉軸中心的距離而變化的。高速和超速離心機的離心條件，有的以每分鍾速度(r/min)表示，有的則以離心力——重力加速度g(980cm/S2)為單位來表示。離心沉澱時，沉降]速度與離心力有關。當運轉角速度為ω，運轉半徑為R時，則：[JZ]離心力g=ω2Rav，ω=(2πr/min)/60，[JZ]g=[SX(]4πr/min2[]3]600×980[SX)]×Rav[HT5”SS][JZ]圖13-2〓角轉頭的橫剖麵圖[JZ]表明從旋轉中心到離心管頂部、中部及底部的距離。[HT5SS] 上式中，Rav為離心管中心至轉軸中心的平均距離(如圖13-2)。從上式可以作]出r/min、R與g三者關係的貫線圖(如圖13-3)。三者中如知其二，就可推算另一數值。如轉速超過7萬，或R為英寸時，可參閱圖13-4。[HT5”SS][JZ]圖13-3〓推算轉頭離心力的貫線圖[JZ]圖13-4〓推算轉頭離心力的貫線圖由此圖可以獲得與半徑相關的相對離心力的值。將尺放在圖左側表示離心頭中的離心管距轉軸中心的距離(即旋轉半徑的標尺)上，]然後使之與預選轉速(即圖右側的離心速度標尺)成一直線，在圖中央的標尺上即可讀出相對]離心力之值。圖中點線表示測量一個相對離心力的例子。[HT5SS]離心機轉速在4000r/min左右的稱為低速(普通)離心機；轉速至25]000r/min左右的]稱為高速]離心機；轉速25]000r/min以上的稱為超速離心機。高速和超速離心機裝有冷凍裝置和抽]真空]裝置，以保持離心腔中恒定的低溫，並減少轉頭運轉時空氣的摩擦力。超速離心機有製備和]分析用兩類，最近又生產出製備、分析及區帶連續離心三用裝置在一起的離心機，有的還帶]掃描裝置。 使用超速離心機的分離提純方法有三種：(1)差速離心法；(2)速度區帶離心法；(3)平衡密度梯度離心法(或等密度梯度離心法)。
1.差速離心法
這是應用較早的簡單方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差別的基礎上。具體做法是將被分離的樣品交替進行低速離心與高速(或超速)離心。沉降速度差別在一個或幾個數量級的粒子，可用本法分離提取。粒子大小、轉速與離心沉澱時間的關係，如圖13-5。[HT5”SS][JZ]圖13-5〓病毒粒子大小、轉速及離心沉澱時間的關係圖[HT5SS]差速離心適用於從組織培養液、雞胚尿囊液或經過紅細胞吸附釋放的病毒]懸液中提純病毒。在由感染細胞或組織勻漿中提取病毒時，由於與病毒大小相近的細胞亞單位及碎片的存在，提純效果不理想。差速離心法的優點是能迅速處理大量樣品，故常作為病毒精製的第一個階段，或者用於病毒樣品的濃縮和粗提。 以差速離心法分離提純病毒時，經常以低速(2]000～3]000r/min，20～30分鍾)及中]速(10]000r/min，20～30分鍾)去除較大的宿主細胞碎片、汙染的細菌及其他較大的雜質。]然後，選擇在60分鍾內能夠沉澱80%以上的病毒粒子的較高速度，離心1～2小時，使病毒沉澱]。對中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經紅細胞吸附釋放後，於25]000r/min離心60分]鍾，即可達到目的。小型病毒如脊髓灰質炎病毒、披膜病毒，則需以35]000～45]000r/min離心1～2小時。高速或超速離心沉澱物，可用研磨和超聲波振蕩等方法打碎後懸浮於緩衝]液中。對於非病毒雜質較多的樣品進行差速離心，由於病毒對沉澱物的非特異性吸附而有較多損失。 ]
2.速度區帶離心法
是根據被分離物質在強大離心力中沉降速度不同而進行的分離方法。該法使用的介質密度應該小於被分離物質的密度。介質可以為均一密度，也可以為梯度密度。當被分離的物質沉降到與介質密度相等的區域時就不再沉降。不同分子形成不同的區帶，而稱為速度區帶。該法要求樣品濃度為頂端濃度梯度的1/10，樣品體積為離心管體積的5%。常用的介質有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒純化時，將病毒樣品溶液層加於密度梯度層的頂部，借助病毒粒子或其亞單位成分本身的浮密度差別，在離心力作用下降到密度相等的介質層內，最後排列成帶狀停留不動。密度較小的粒子或成分停留在上麵的幾層內，密度較大的粒子或成分沉降於下麵幾層內。應用密度梯度法，可以獲得相當純淨的病毒樣品。病毒粒子或成分的沉降速度取決於其大小、形狀及比重，也取決於離心力及懸液介質的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分離時最常應用的材料，因其易溶於水，且對核酸及蛋白質呈化學惰性。常用的梯度範圍從5%～20%：10%～60%。蔗糖濃度梯度離心後，蔗糖溶液的密度以折射法測定折射率，按如下公式計算：[JZ]ρ=27329η20-26425蔗糖溶液的折射率如表13-2。 除蔗糖濃度連續梯度離心外，近來有人在兩層濃度梯度上層加病毒濃縮樣品，]經超速離心後將病毒收集於兩層界麵處；也有人在單層蔗糖濃度溶液上層加病毒濃縮樣品，]經超速離心，使病毒沉澱於蔗糖溶液底部。這兩種方法比較簡單，但濃縮提純的效果遠遠不]如多層連續梯度法。
3.平衡密度梯度離心法
平衡密度梯度離心法是根據粒子的浮密度不同而加以分離。所謂浮密度就是物質的質量減去在一定介質中所受的浮力，亦稱有效密度。[JZ]浮密度(有效密度)=m-m(ρ0/ρ)m為物質質量，ρ為物質密度，ρ0為介質密度。常用的介質有氯化銫(CsCl)、氯化銣(Rb]Cl)、硫酸銫(Cs2SO4)、溴化鉀(KBr)、酒石酸鉀(K2C4H4O6)等無機或有機鹽。]病毒離心時，病毒粒子ρ比介質密度ρ0大，即ρ>ρ0病毒沉澱，ρ<ρ0時則上浮。]製備梯度的方法有兩種：一種是在飽和的CsCI溶液上麵層加病毒樣品(容量比1∶4)；]另]一種是將病毒樣品與CsCl濃溶液均勻地混合。一般用水平轉頭，經較長時間的超速離心，在]離心管中形成CsCl的濃度梯度，並由於離心力的作用，樣品中的病毒粒子分布於相應密度的]區域內。這種方法在分析離心中是最常用的。應用本法時，離心轉頭的回轉數越高，離心時]間越長，越能接近平衡狀態。 平衡密度梯度離心法廣泛應用於病毒和核酸的提純上。用平衡密度梯度離心法提純的動物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型腦炎病毒、狂犬病病毒和馬傳貧病毒等。有的病毒在這些無機鹽類溶液中被破壞，可加入02%～05%牛血清白蛋白，或用05%～30%甲]醛先將病毒粒子固定，然後進行平衡密度梯度離心，常能較好地回收病毒。大多數病毒的浮密度在110～140範圍內，見表13-3。所以製備密度範圍為10～17的懸浮介質，便可滿]足大多數病毒密度梯度離心的需要。用CsCl溶液進行平衡密度梯度離心時，以測定25℃時CsCl溶液的折射率(ｎ25]D的方法)，按照下列公式求得各梯度分層液的密度：密度範圍為ρ＝100～138g/cm3時，ρ25=102402ｎ25D-126423〓](式1)密度範圍為ρ=137～19g/cm3時，ρ25=108601ｎ25D-134974〓(]式2)ｎ25D指各梯度分層液在25℃時的折射率，ρ25指各梯度分層液在25℃時的]密度。例①〓以馬傳貧病毒在CsCl平衡密度梯度離心後提純於第12分段部位中，此部分CsCl溶]液折射率為13510，求其密度： 將所得折射率代入式1中，則[JZ] ρ25=102402×13510-126423=11923 即馬傳貧病毒浮密度約為119。 例②〓急性傳貧馬血清中遊離鐵蛋白在CsCl平衡密度梯度離心後提純於第18分段部位]，此部分CsCl溶液折射率為13811，求其密度： 將所得折射率代入式2中，則[JZ] ρ25=106801×13811-134974=15014 即鐵蛋白浮密度約為150。 各種無機鹽溶液的密度與折射率的關係，一般以下列公式表示：[JZ] ρ=a•n-b 如果知道各種鹽類溶液的係數a和b，即可按測定折射率的方法簡單地求得其密度。由折射率計算密度時，常用溶質的質數a和b值及其密度的適用範圍如表13-5。
4.兩種超離方法的比較
速度區帶離心法和平衡密度梯度離心法各有特點，現將這兩種超離方法加以比較，具體見表]13-6[JZ][HT5”H]表13-6〓速度梯度離心法與平衡密度梯度離心法的特點[HT6SS][]BG(!][BHDFG2，WK11，WK20ZQ，WK20ZQW][]速度區帶離心法[]平衡密度梯度離心法][BHDG4]原理[]沉降與顆粒質量成正比，以物質沉降速度的不同進行分離[]沉降與顆粒的密度成]正比，以物質的浮密度不同進行分離[BHDG6]介質[]密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖濃度10%67%，密度1～13286預製梯度，]不連]續[]密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl濃度0～1355，密度為1～19025，自成連續梯]度[BHG4]離心力場[]強，離心速度高，使被分離物質易沉降[]稍強，速度相對低，使CsCl形成梯]度，建立沉降擴散平衡[BHG4]離心過程[]樣品向離心管底沉降[]不論樣品起始時在什麽位置，離心中樣品停留於介質]的等密度部位[BHG2]離心時間[]較短，一般為幾小時到幾十小時[]較長，十幾小時到數天[BG)F]
5.密度梯度離心法的操作程序
(1)密度梯度的製備：製備密度梯度的方法有不連續的(即人工操作)和連續的(即機械操作)密度梯度兩種。 不連續的或分層的密度梯度的製備 不連續的密度梯度是以人工操作法製備的，在一定溫度下(一般在20℃或在25℃)配製一係列濃度差為5%的梯度溶液，例如蔗糖可配製成5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、]40%(W/V)等溶液(用蒸餾水或適宜的緩衝液配製)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取濃度最大的溶液注入離心管底，然後依次加入較低的各個濃度(40%→5%)，一層覆蓋著一層地層加於離心管中，注意避免產生氣泡。假如各層界麵被衝動破壞，則應重新製備。也可]以將長針頭插入管底，依次從濃度低到高加入各溶液。 連續的密度梯度的製備 為了產生一個連續的密度梯度，常用梯度混合裝置來製備梯度。 [HT5”SS][JZ]圖13-6〓簡易的密度梯度溶液製備裝置[JZ]A、B為盛蔗糖溶液的玻璃管。[JZ]1活塞雙通；2攪拌棒；3活塞；4連接處；5聚乙烯小管[HT5SS]梯度混合裝置如圖13-6，由A和B管組成。兩管之間用雙通活塞聯結。在活塞]關閉的狀態下，向A管中加入低濃度蔗糖溶液，向B管中加入高濃度的蔗糖溶液，兩管中容量要相等。在B管出口處用一根聚乙烯小管連接到離心管。在給B管充液時，可將聚乙烯小管的流出口向上轉動，使之超過液體的水平麵，從而阻止液體流出。充液後可將小管接到離心管中使之貼著管壁，然後開動小攪拌器，使攪拌棒轉動，同時打開兩管間活塞。這三個操作要同時進行，以保證梯度的連續性。當梯度液體自B管流出時不允許移動離心管，待離心管中所盛的梯度溶液的體積達到需要量之後，將離心管小心地靜止於4℃1～2小時，以平衡之。 現在不少“製備用超速離心機”攜帶有“密度梯度製備自動裝置”。按照這個方法製備的蔗糖濃度梯度，理論上按下式計算：[JZ]C=CA-(CA-CB)(1-V)-b/aA管和B管的橫斷麵積各為a、b，其中所含蔗糖濃度分別為CA、CB，兩液開始混合以]後流出Vml時流出液的濃度為C。A和B管的橫斷麵積一般情況下相等，故a=b，這時獲得的梯度為直線梯度。如果a≠b時，離心管中濃度梯度產生凸形和凹形梯度曲線。這些濃度梯度是根據樣品和實驗目的而專門選用的。一般使用的濃度梯度範圍為20%→5%，40%→10%，或60%→10%等。
(2)加入樣品：用如上所述注射器或微量吸管吸取懸浮於適宜緩衝液中的病毒或核酸樣品(約梯度介質體積的1/10容量)，從液麵上方1mm處，緊貼著離心管壁輕輕層加於梯度介質麵上。
(3)高速或超速離心：將加入樣品的離心管裝入套管內，也可將離心管置於轉頭的套管內，以免在裝進套管時震動液體。擰緊套管螺帽，將套管吊在水平轉頭上，置於離心機內。梯度離心一般用高速或超速離心機。離心速度和時間，根據所分離的樣品選定。離心開始，樣品中各種粒子逐漸分離，分布於相應的密度梯度層中成為帶狀(如為透明的聚碳酸酯離心管，則可以清楚地見到帶狀分離，並拍照)。離心時間到時，使離心機自然停止，不許製動，以免破壞梯度。
(4)梯度的分段收集(取樣)：在離心完了以後，為了把已分離物質的各條帶分開，必須取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下幾種。
①取代法：從離心管底部穿刺或將帶長針頭的注射器插入離心管底，使一種稠密]的介質，如60%～70%(W/V)蔗糖溶液，緩慢地注入於離心管底部。然後用一個注射器或移液管，從上麵逐一移出各部分。或者在離心管的頸部加上一個塞子，這個塞子附著一根收集導管，通向一個部分收集器，收取各部分。
②穿刺法：將離心管固定於特製的固定架上，在其底部裝上一個垂直向上的空心針穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小試管分段收集。超速離心機一般都帶有此裝置。此裝置的缺點是離心管在用一次後即廢棄。
③虹吸法：此法的優點是不必穿刺離心管，離心管可反複使用。經多次試證實，此法簡]便易行，對梯度密度無破壞。用一根大穿刺針截兩段做虹吸管，以接上50～100ml玻璃注射器進行送氣的方法，分段收集梯度溶液。[HT5”SS][JZ]圖13-7〓從分部密度梯度中的分部收集[HT5”SS][GK4]從分部密度梯度中的分部收集A、B部分由有機玻璃製成，並利用螺帽C]緊密地裝在一起，利用O形墊圈封起來。通過注入濃蔗糖溶液使管內成分緩緩向上擠入錐形]收集中而流出[HK] [HT5SS] ④注射器吸取法：用彎曲的針頭(J狀)接在注射器上，從梯度最上層開始向]下逐層小心吸取液體。
6.梯度各層液體的密度測定
(1)稱重量法：用10ul微量注射器吸取樣品，加入於已知重量的毛細管中，在1/10萬分析天秤上稱重，計算重量(g/ml)，即為梯度溶液的密度。
(2)測定折射率法：用阿貝氏折光儀測定各梯度層溶液的折射率(25℃)，然後按照前述的公式ρ25=a•ｎ25D-b 換算成密度(g/ml)。
(3)浮漂法：向已製備好的各種密度溶液中滴入一滴樣品，找出相應的樣品浮密度溶液，即為該梯度層的密度。
7.各梯度分層液中病毒分布的鑒定
(1)以紫外分光光度計測定蛋白質和核酸吸收峰。吸取各層梯度溶液，用蒸餾水或緩衝液適當稀釋後，測定波長280和260nm的OD值。然後以各梯度層管號為橫坐標，其OD值為縱坐標畫曲線，即為各梯度層中蛋白質病毒含量圖，有些病毒260nm]OD值較高。
(2)以各種血清學方法測定各梯度層中病毒的抗原效價；或用組織培養法測定病毒滴度，證實病毒分布區域。
(3)用電子顯微鏡負染法觀察病毒粒子及其純度。將各梯度層樣品裝入透析袋中，置於適宜的溶液中透析去鹽，然後取一滴樣品用蒸餾水稀釋，滴附於銅網膜上，用磷鎢酸負染後電鏡下觀察病毒粒子。
上一篇：電泳法-病毒提純方法
下一篇：超濾法-病毒提純方法
