病毒基因的克隆是在原核細胞中進行的。可以采用細菌質粒、粘性質粒或λ噬菌體作為載體，但最常應用細菌質粒載體，在大腸杆菌( E.coli )中進行。用於基因克隆的質粒必須具備3個主要結構特征：1、具有負責其 在宿主細 胞中自主複製的複製起始區(Ori)；2、具有克隆後便於篩選的標記基因(如對各種抗生素的 抗性 基因等)；3、含有外源基因的克隆位點。常用的質粒有pUC18/pUC19和pBR322等。pUC18/pUC 19為高拷貝質粒(120～200個／細胞)，含有多克隆位點，以可滿足多種內切酶切割的DNA片 段的克隆；pBR322為中拷貝質粒(50～80個／細胞)。病毒基因克隆的目的在於：1、病毒 基因片段的大量製備；2、序列分析；3、基因表達與調控研究；4、構建病毒載體；5、製備 核酸探針等。病毒的基因組 有DNA和RNA以及雙鏈和單鏈之分。在著手進行基因克隆前，了解目的病毒的核酸類型是必 要的。對不同類型的病毒，采用不同的基因克隆方法:DNA病毒可在限製性內切酶切割後直接 進行克隆；RNA病毒則必須先在試管內反轉錄成cDNA後再行克隆；反轉錄病毒可從感染細胞 中提取前病毒DNA，隨後再行克隆。總的來說，病毒基因的克隆包括以下幾種類型：單鏈DNA病毒的基因克隆 主要指細小病毒科成員。這類病毒的基因組為 單鏈線狀DNA,兩端因回文序列而形成發夾結構，這一結構是病毒基因組複製的引物，因此 在 感染過程中，病毒基因組可在宿主細胞內形成雙鏈DNA形式的中間複製型DNA。提取這種複製 型DNA，用單鏈核酸酶去除兩端的發夾結構，就可對該病毒全基因組進行克隆;也可用適當的內切酶切割後，回收所需的片段進行克隆。 雙鏈DNA病毒的基因克隆 絕大多數的動物致病性DNA病毒含有雙鏈DNA基因組,但是它們之間的差別較大。對於較小的 雙鏈DNA病毒， 如SV40、乙型肝炎病毒等，它們的基因組為環狀雙鏈DNA。在克隆時，使用對這些環狀DNA隻有單一切點的內切酶切割，然後與適當的載體連接，就可以建立全病毒基因組的無性繁殖係。對於較大的雙鏈DNA病毒，如痘病 毒科和皰疹病毒科的成員，克隆它們的全基因組十分困難。必須用適當的內切酶將基因組切成較小的片段，然後再建立各片段的無性繁殖係，即建立基因組文庫。或者根據研 究目的，回收其中的目的片段進行目的克隆。但是，這類病毒DNA均為線狀雙鏈，在克隆二 個末端片段時，必須對兩端的基因片段的末端進行修飾，如補平或加接頭，然後再行連接 克隆。 RNA病毒的基因克隆 對分節段的RNA病毒，如流感病毒、呼腸孤病 毒和輪狀病毒等基因組，可以先分離特定的RNA片段，反轉錄cDNA後，與適當的載體質粒， 加G/C尾或A/T尾進行連接。對不分節段的RNA病毒基因組，也要分段反轉錄成cDNA後，進行 克隆。 病毒基因組中某一特定基因片段的克隆 如果已經了解這一病毒基 因組的酶切圖譜，則可選用適當的限製性內切酶切割病毒基因組，回收特定片段，重組到適當的質粒載體，進行克隆；如果知道需要克隆的基因片段的序列，便可設計並化學合成一對 特異引物，用PCR法擴增這一片段，然後重組到適當的質粒載體進行克隆。雖然由於病毒種類和實驗目的的不同，基因克隆的方法也不盡相同，但任何一種病毒基因克隆方法均有3 個 主要步驟：1、病毒基因組的提取；2、與質粒載體的連接重組；3、重組質粒的篩選、鑒定 。現分別描述如下： 1、病毒基因組的提取 這是基因克隆的一個重要環節。其基本原則是：先從感染組織或細胞,以及含病毒排泄物和分泌物中提取病毒粒子，然 後 去除病毒蛋白，提取病毒核酸。在提取過程中，要注意避免核酸酶對病毒核酸的降解作用。特別是在提取RNA時，所用的試劑和用品均需要事先進行無RNase處理或高壓滅菌。此外在提取較大分子量的病毒DNA時(如痘病毒DNA)，要徹底去除病毒蛋白(通常使用蛋白酶K)和避免 劇烈振蕩(否則核酸鏈斷裂)。從純化的病毒粒子提取病毒核酸的一般方法如下：①取適量純化的病毒粒子(病毒純化方法詳見第十三章)；②②加入蛋白酶K至終濃度500μg/ml、SDS至終濃度1%，37℃水浴30分鍾；③加等體積酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次；④於水相中加1/10體積25mol/L KAC或5mol/L NaCl，再加25倍體積無水乙醇,置-20℃ 至少2小時或-80℃(或液氮氣相)15分鍾；⑤在4℃下，15 000r/min離心15分鍾，小心吸去上清；⑥70%冷乙醇洗滌沉澱，真空抽幹，或置37℃幹燥，最後根據需要加適量無菌去離子 水或TE緩衝液(10mmol/L Tris•HCl, pH80, 1mmol/L EDTA)溶解核酸沉澱，-20℃保存備 用。 這樣提取的核酸純度較高，如果是DNA，則可直接用於酶切與克隆；如果是RNA，則可直接 進行常規反轉錄合成cDNA,或者應用反轉錄PCR擴增所需基因片段（詳見本章第五節）。PCR不要求十分純淨的病毒。可直接用聚乙二醇(PEG)濃縮的病 毒提取核酸樣品。對不易純化的病毒進行基因克隆時，可在病毒粒子裝配之前，病毒核酸複製達高峰時，直接提取感染細胞的核酸，用PCR方法擴增所需的基因並克隆之。現以豬瘟病 毒感染細胞總RNA的提取方法為例，介紹如下：(1)創造一個無RNA酶(RNase)的環境: RNa se無處不在，很難滅活。RNA在提取過程中極易被其汙染而降解，為了能提取到完整的RNA 樣品，應創造一個無RNase的環境。為此，必須做到以下幾點：①必須采用滅菌的一次性 塑料製品，不得重複使用。我們經驗表明這些塑料製品無RNase汙染，不需預先進行RNase滅 活處理；②非一次性的玻璃和塑料用品須在使用前適當處理，以確保無RNase。玻璃器皿 應於250℃幹烤4hr，塑料器皿應用005%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡過夜，然後高壓滅菌; ③所有溶液(Tris除外)均須加入005%的DEPC，室溫處理過夜，然後高壓滅菌，去除DEPC； ④整個操作過程應戴一次性手套。(2)感染細胞總RNA的提取:①單層細胞在接種病毒4 8hr後，傾棄培養液，用滅菌的冷PBS(001mol/L，pH74)將細胞單層洗2遍；②按每10 8細胞加8ml變性溶液於感染細胞單層上，輕微搖動，直至細胞裂解脫落。此時，溶液變粘稠。變性溶液的成分為4mol/L異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉(pH70)，05%十二烷基肌氨 酸鈉（Sarkosyl）， 01mmol/L β巰基乙醇;③用吸管將此細胞裂解液轉移至50ml錐 形滅菌離心管中; ④加入1/10體積的2 mol/L NaAc(pH40)於上述裂解細胞液中，顛倒並充分混勻；⑤加等量水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(50∶49∶1)混合物，顛倒混合，輕輕振蕩10秒，冰浴15分鍾； ⑥4℃，8 000r/min離心20分鍾；⑦小心吸取含RNA的上層水相至另一新的50ml離心管中; ⑧加等量異丙醇，置-20℃過夜,或液氮氣相(或-70℃)15 分鍾;⑨4℃，8 000r/min離心15分鍾沉澱RNA，傾去上清；10將RNA沉澱重懸於5ml變性溶液中，為加速溶解，可65℃短時加熱；11重複⑧、⑨步。12用75%的冷乙醇洗RNA沉澱2遍。13RNA沉澱在真空抽幹機中幹燥15～20分鍾，但不要完全幹燥，以免難以溶解；14將RNA溶於1ml無RNase的去離子水中，-20℃貯存。如欲長期保存，可加NaAc(pH5 0)至終濃度02mol/L，而後加25倍體積的無水乙醇，置-70℃貯存。 2、連接重組 即在試管中將病毒DNA(包括cDNA)與適當酶切的質粒載體DN A連接在一起，形成重組質粒，從而構建病毒DNA的無性繁殖係。將病毒基因片段連接到質粒 載體上時，可有以下幾種連接方式：①最常用的是粘端連接。若DNA插入片段與適當的 載體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同一種內切酶產生 的粘性末端和不同的內切酶產生的互補粘性末端，後者連接成的DNA不能再被原切割內切酶 識別，而不利於從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。同源粘性末端連接效率高，但 也存在弊端，例如插入片段存在兩個方向插入的可能性；插入片段間可相互連接，導致載體中可能存在幾個插入片段；載體自身環化機率高，故應在連接前，將酶切完全的質粒載體DN A用堿性磷酸酶處理，使其5端去磷酸化以減少自身環化，降低假陽性重組子背景。②如 重組對象不適合粘端連接，則可以用平端連接進行重組。通常的做法是用產生平端的內切酶切割載體。如用產生粘端的內切酶切割載體，其產生的粘端若是5端突出的，需要用DNA 聚合酶將粘端補平；若是3端突出的，需要用單鏈核酸酶或T4 DNA聚合酶(它有35 外切酶活性)將突出的3端削平。病毒DNA同樣也需補平或削平，將其修飾成平端。然後再 用連接酶將它們連接在一起。平端連接的特點是可以恢複一個原始的，甚至產生一個新的酶切位點。位點的恢複或創建是十分有用的，它提供了一條簡捷的重組子篩選鑒定途徑，並可 方便地使插入片段重新從重組子中回收出來。平端連接存在的弊端是它的連接效率比粘端連接低得多，連接時需要高濃度的連接酶和高濃度的DNA末端(大於1μmol),而且插入方向不確 定。③也可以一端是粘端，另一端是平端進行連接。例如要把 Eco RI/ Hae Ⅲ的目的基因克隆到pBR322上時，首先用 Hin dⅢ切開質粒DNA，用大腸杆菌DNA多聚酶I的Klenow片段，修補 Hin dⅢ消化後的5端突出部分，使之成為平端，再用 Eco RI消化，電泳純化，所得載體DNA的一端為平端，另一端 為 Eco RI粘端。這樣就可以與 Eco RI/ Hae Ⅲ的目的基因進行連接。連接中，外源DNA片段 的插入隻有一種可能性，有助於病毒DNA與載體的定向克隆。④將病毒DNA修飾成平端後，可用酶促法在二端加上適當的接頭(linker)或適配子(adaptor) ，將其修飾成粘端，然後再與相同粘端的載體連接。這種連接雖然有助於病毒DNA片段的 回收，但是修飾過程複雜，效率也低，轉化細菌後非重組背景高，且可能有多拷貝插入及雙 向插入等。 3、載體選擇與處理 用於分子生物學診斷的病毒基因克隆通 常使用的質粒載體是pBR322及其衍生質粒和pUC係列質粒(pUC18/pUC19)等(見圖15-1,圖15-2 ),它們均屬鬆弛控製型質粒，在宿主細菌細胞中有很高的拷貝數，在用氯黴素或壯觀黴素擴增後拷貝數可超過1 000，因此病毒基因片段插入這類質粒以後，可以大量製備。質粒pBR32 2含有氨苄青黴素(Ampr)和四環素(Tetr)抗性基因，含該質粒的細菌可抵抗這二種抗生 素。該質粒的全序列已被測定，外源DNA片段可克隆到四環素基因中的單一酶切位點 Cla I、 Hin dⅢ、 Ba m HI或 Sal I,從而導致Tetr基因滅活，轉化 細菌就隻抗Amp而對Tet敏感；外源DNA片段也可克隆到Ampr基因中的單一酶切位點 Pst I或 Pvu I,從而導致Ampr基因滅活，轉化細菌就 隻抗Tet而對Amp敏感。pUC18/pUC19克隆質粒均含有一個多克隆位點，外源DNA片段可插入多克隆位點中的任何酶切點，可粘端連接，也可平端連接。由於pUC18/pUC19質粒可表達LacZ 見後述)，而外源DNA插入多克隆位點將阻礙β 半乳糖苷酶氨基端片段的表達，從而 破壞了α互補。因此可以用組織化學篩選法挑選重組質粒。pUC18與pUC19的區別僅限於多克 隆位點的方向相反，在其他方麵並無不同。上述細菌質粒主要用於較小的病 毒DNA片段(＜10kb)的常規克隆，如果要克隆10kb以上的病毒DNA片段，通常使用粘性質粒和 λ噬菌體載體。克隆成功與否,除與連接方式以及載體選擇有關外，載體的處理也是一 個重要環節。為了提高連接效率，處理載體時應注意以下幾點： (1)應加入常用量5～10倍的內切酶水解載體，以保證載體被完全酶切；(2)如用雙酶切割 載體，則必須電泳回收載體片段，除去雙酶切所產生的小DNA片段；(3)如粘端連接,單酶 切處理過的載體必須用堿性磷酸酶(如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，防止載體自身環化。C IP可以水解掉DNA5末端的磷酸。對於3末端突出的DNA(如 Pst I水解，需用10倍於5末端突出DNA(如 Eco RI, Hin dⅢ)的CIP進行去磷酸化，以達到最少的載體自身環化。去磷酸方 法如下：①DNA加入10倍去磷酸化緩衝液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基團加 入1個單位的CIP，37℃反應30分鍾。平末端或3端突出的DNA，每2pmol 5磷酸基團加1個 單位CIP，37℃保溫15分鍾後，再加CIP，55℃反應45分鍾(2μg 5kb的線性DNA約含14pmol 左右的5磷酸基團)；②加入SDS、EDTA(pH80)和蛋白酶K分別至終濃度05%、 5mmol/ L和50μg/ml，混勻後56℃反應30分鍾；或加EDTA(pH80)至終濃度為5mmol/L，65℃保 溫1小時或75℃，10分鍾滅活CIP;③冷卻至室溫後，加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一 次;④乙醇沉澱，離心，抽幹，溶於無菌去離子水，濃度最好為100μg/ml,-20℃保存備 用。 10倍CIP去磷酸化緩衝液： 10 mmol/L ZnCl2 10 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris•HCl,pH80 4、DNA片段的體外連接 DNA片段間的體外連接是DNA克隆的核心步驟，本質上是一個酶促的生物化學過程， 這個酶稱為DNA連接酶(DNA ligase)，主要有二種：T4噬菌體DNA連接酶(簡稱T4 DNA連 接酶)和大腸杆菌DNA連接酶，它們能將兩個獨立的DNA片段形成磷酸二酯鏈共價連接,但 以T4 DNA連接酶的應用最為廣泛。由於大腸杆菌DNA連接酶對DNA末端要求嚴格(同源粘端) ，而且幾乎不能催化平端DNA分子間的連接，所以不常使用。連接反應中的各種成份及其組成的體係不同程度地影響著連接反應的速率和產物形成。對於平端連接,在T4 RNA連接 酶 存在時，T4 DNA連接酶的連接效率可提高20倍。濃度為15%的PEG8 000可顯著提高 平端連接效率1～3個數量級，因此可使連接反應在酶和DNA濃度不高的條件下進行。連接反應中的ATP是T4 DNA連接酶的輔助因子，其濃度 對酶的催化活性影響很大。在ATP濃度為05～5 mmol/L範圍內，ATP濃度升高對T4 DNA連 接酶產生可逆性抑製，當ATP高達75mmol/L時，對連接酶的粘/平端連接活性均有抑製作用。所以在連接時，平端連接用較低ATP濃度(05mmol/L),粘端連接一般用05～10mmol/L AT P。連接反應中，DNA末端的濃度、載體與片段的比例將直接影響連接物的產率和分子構型 。如果DNA濃度過低，DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高於找到不同DN A分子的末端的概率。結果造成質粒DNA過多地自身環化(即分子內連接)，有效連接產物明顯降低;如果連接反應中DNA濃度有所提高,則在分子內連接發生之前，某一個DNA分子的末端 碰到另一個DNA分子末端的可能性也有所增大，有效連接產物明顯增加。不同大小的分子， 其所需DNA的濃度也不一樣，一般來說分子越大，連接時所需的DNA濃度越小。就pUC18載 體 而言，有效連接的DNA濃度應為20～60μg/ml。對於一個給定的連接混合物而言，產生有效 重組子的效率不僅受反應中末端的絕對濃度的影響，而且還受載體與外源DNA末端的相對濃 度的影響，如外源DNA末端濃度比載體低得多，有效連接產物的數量將很低，以致最後很難挑選 出帶重組子的轉化菌落。如外源DNA末端濃度比載體高得多，連接時將導致大量寡聚體分子 的形成,同樣影響有效連接。一般來說，在連接反應中外源DNA末端的濃度是載體的2～3倍時 ，有效連接率最高，產生有效重組子的數量最多。連接反應的操作步驟如下：①取100 ～200ng CIP去磷的線性載體DNA，加入2倍摩爾數的外源DNA片段；②加入2μl 10倍T 4 DNA連接酶緩衝液；③加入ATP終濃度05～1mmol/L(平端連接時為05mol/L )；④ 加入滅菌去離子水補足19μl；⑤加入1μl T4 DNA連接酶，酶的活性高時少加，但 平端連接要盡可能多加，不過加酶的最大體積不超過反應總體積的1/10，否則其中的 防凍保護甘油將影響酶的活性。另外，加入1單位T4 RNA連接酶可使平端連接效率增加約2 0倍; ⑥16℃連接4小時，或4℃連接過夜；⑦75℃滅活連接酶，終止反應，取2μl電泳 鑒定是否已經連接；⑧取3～5μl轉化感受態菌。 10倍T4 DNA連 接酶緩衝液： 200 mmol/L Tris•HCl pH8050 mmol/L MgCl250 mmol/L DTT500μ g/ml BSA組分Ⅴ(也可不用) 對於具體的連接體係，包括反應體積、時間、溫度、DNA濃度及酶的用量等都可根據實際情況作相應的調整，但反應體積一般不超過50μl， 溫度不超過25℃，時間為2～16小時。 5、轉化大腸杆菌 體外連接的重組 子，隻有導入適宜的大腸杆菌受體後，才能隨著大腸杆菌的增殖而大量複製和擴增，從中提取大量的克隆基因。質粒DNA或以其它載體構建的重組子導入細菌的過程，稱為轉化。轉 化時，受體細菌必須經過特殊處理，誘導細菌產生一種短暫的“感受態”，這樣才能攝入各種不同來源的DNA。這種處理過的受體細菌，即為“感受態菌”。感受態菌的製備及轉化方 法如下：①將宿主菌在瓊脂培養基平板上劃線，37℃培養16～20小時;②從平板中取出1個2～3mm大小的單菌落，移至含100ml LB 培養基的500ml三角瓶中，37℃ 300r/min 強烈振蕩培養3小時，使細菌的OD600達02～04;③將培養物置冰浴10分鍾，然後轉移到離心管中，4 000r/min,4℃離心20分鍾;④棄上清，倒盡剩餘液體，加入10ml 冰預冷的01mol/L CaCl2,置冰浴10分鍾;⑤4 000r/min，4℃離心20分鍾，棄上清，每100ml的原培養物再加入4ml預冷的01 mol/L CaCl2溶液，懸浮細菌;⑥按每份200 μl分裝細菌，若不馬上進行轉化，該感受態菌可以加入終濃度為10%的滅菌甘油，置-70 ℃凍存;⑦加10μl含40ng的質粒DNA溶液至200μl感受態菌中，混勻後，置冰浴30～60 分鍾。同時設立兩個對照組：取10ng(10μl)已知的超螺旋質粒DNA加至感受態菌中，作陽 性對照；不加任何DNA的感受態菌作陰性對照;⑧42℃熱衝擊90秒鍾，迅速放回冰 浴冷卻1～2分鍾後，加入800μl LB培養基，37℃靜置培養60分鍾;⑨取200μl轉化菌液鋪於90mm直徑的LB瓊脂平板上(瓊脂中含有適當濃度的抗生素)，室溫下放置20～30分鍾，待溶液被瓊脂吸收後，倒置平皿，於37℃培養12～16小時後即可觀察到抗性菌落。用氯化鈣 製備的感受態菌可使每μG超螺旋質粒DNA產生5×106～2×107個轉化菌落，這樣的 轉 化率足以滿足所有在質粒中進行病毒基因常規克隆的需要。該方法完全適用於大多數大腸杆菌菌株，重複性很好。製備的感受態菌可保存於-70℃或液氮氣相，但保存時間過長會使 轉化效率受到一定影響。除上述自製感受態菌外，也可以從商業途徑購買製備好的凍存的各種感受態菌，這些產品非常可靠，一般每μG超螺旋質粒DNA可產生108以上轉化菌落。 電穿孔法是另一個有效的轉化細菌途徑，適用於各種細菌，轉化率比化學法製備的感受態菌高10～20倍，可達109～1010落菌／μg質粒DNA。其原理是以高電壓(數千伏 )在很短時間(微秒時間)內脈衝電擊細菌細胞，使細胞膜產生許多小孔，質粒DNA通過這些小 孔進入菌體而轉化。針對不同的菌株，需要優化各種參數，包括電場強度、脈衝長度、脈衝 次數、電極與樣品的距離以及細菌和DNA濃度等。更高的電壓、更長的脈衝時間雖然能提 高轉化率，但細菌的存活率降低。電穿孔法操作簡單，製備用於電穿孔的細菌比製備感受態菌容易。細菌生長到對數中期後加以冷卻，離心，然後用低鹽緩衝液充分清洗以降低細菌懸 液的離子強度,但不必形成原生質體。然後用10%甘油重懸細菌，使其濃度為3×10 10細菌／ml，在幹冰上速凍後置－７０℃貯存。這樣，每小份細菌融解後即可用於轉化， 其有效期至少為6個月。電穿孔在低溫下(0～4℃)進行，如果在室溫下操作，轉化效率可能 會降低百倍。電穿孔法需要一台特殊的精密儀器——電轉移儀，它能很好地選擇和控製各種參數，以求最佳效果，許多廠商都生產這種儀器，但因價格昂貴，限製了此方法的廣 泛應用。 6.重組子的篩選與鑒定 基因克隆過程中，DNA的連接往往不夠 理想：載體DNA即使已用CIP處理，由於反應不完全，常常發生自身環化；載體的酶切可能不 完全，以及出現好幾種連接情況等等。在建立病毒基因文庫時，載體與不同DNA片段連接後 ，也 形成不同的重組子。故在轉化以後，從轉化細菌菌落中挑選試驗者所設計和期望的重組子是 病毒基因克隆中最後一道重要工序。挑選後，通過細菌培養以擴增所需重組子，回收所需基因片段的大量拷貝，以便進一步研究該基因的結構、功能或表達該基因產物。雖然不同 的克隆載體及相應的宿主係統，其重組子的篩選、鑒定方法不盡相同，但均采用以下幾種基本方法：(1)快速法提取質粒鑒定大小: 用牙簽從平板上直接挑取菌落，加入50μl裂 解緩衝液(50mmol/L NaOH,5mmol/L EDTA,05%SDS,10%甘油，002%溴酚蘭)立即振蕩打散 細菌，去掉牙簽，取30μl於08%瓊脂糖凝膠電泳，同時電泳載體質粒對照，EB染色後，紫 外燈下觀察是否有比載體質粒大的重組子帶，根據編號從平板上挑取相應菌落，培養3~5ml 菌液，提取重組子DNA進行酶切分析。本法快速、簡單。一次可處理約40個菌落，一天可鑒 定約200個菌落，可作重組子的最初篩選。(2)β 半乳糖苷酶篩選係統(α互補): 現在使用的許多載體,如pUC係列、M13 噬菌體載體和pGEM係列等都帶有一個大腸杆菌DNA片段，其中含有β半乳糖苷酶基因(la cZ)的調控序列和N端146個氨基酸的編碼序列，這個編碼序列中插入了一個多克隆位點，它 並不破壞讀碼框架。這種載體適用於可編碼β半乳糖苷酶C端部分的宿主細胞。雖然宿主 和質粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體，形成具有酶活性的蛋白質。這 樣，lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β半乳糖 苷酶陰性的突變體之間實現互補，這種現象叫α互補。由α互補而產生的Lac+細菌易於識 別，因為它們在生色底物5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)存在下形成藍色菌落。然而外源DNA片段插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可避免地導致產生無α互補能 力的氨基端片段。因此，帶重組質粒的細菌形成白色菌落。這一簡單的顏色試驗大大簡化了在這種質粒載體中鑒定重組子的工作。僅僅通過目測就可以輕而易舉地從數千個菌落中挑選 出可能帶有重組質粒的菌落。但是並非所有白色菌落均帶有重組質粒，所以最後必須通過小量製備質粒DNA進行限製性酶切分析，才能確定帶有重組質粒的菌落。操作步驟如下：① 在一事先製備好的含相應抗生素的LB瓊脂平板上加40μl Xgal(以20mg/ml的濃度溶於二甲 基甲酰胺中)和4μL異丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)溶液(濃度為200mg/ml)，均勻地塗 布整個瓊脂表麵，置37℃使表麵液體揮發；②將轉化菌液100~200μl塗布於上述平板表麵 ，液體吸幹後，於37℃倒置培養過夜(12~16小時)；③將平板放置4℃數小時，使藍色充分 顯現，然後觀察。帶有重組子的細菌將形成白色菌落(無α互補)，可將其挑出，小量製備質 粒DNA,進行酶切分析。帶有載體質粒的細菌，將仍形成藍色菌落(α互補)。(3)插入滅活篩選: 這種方法隻能用於比較老的載體，這些載體帶有兩個或更多個抗生素抗性基因和 分布適宜的限製性酶切位點。如前所述的pBR322載體，它含有四環素(Tetr)和氨苄青黴素 (Ampr)二個抗性基因。以外源片段插入滅活Tetr基因為例。連接物轉化細菌後塗布含 Amp的平板，長出的菌落一些含重組子，另一些則含有在連接中自身環化的質粒DNA，為區別兩種轉化體，可以用分別含有氨苄青黴素和四環素的兩種平板，在互相對應的位置上，各自 接入同一菌落，照此將一批菌落接種於平板的各處。在四環素平板中存活並生長的菌落含有帶活性的Tetr基因的質粒，這樣的質粒不可能有外源DNA插入。在四環素平皿中不生長而 在氨苄青黴素平板中生長的菌落含有帶滅活的Tetr基因的質粒，這些質粒可能帶有外源DN A序列，最後小量提取這些質粒DNA進行酶切鑒定。(4)菌落原位雜交篩選:以放射性或 非放射性方法標記需要克隆的病毒DNA片段，以此作為基因探針，對連接物轉化的菌落進行原位雜交，也是鑒定含有重組子的菌落的常用技術。這種方法很容易同時篩選數十萬個細菌 菌落，從中找出帶有試驗者所需要的重組子的菌落，是從基因文庫中挑選目的重組子的首選方法。現以從少量菌落中挑選出目的重組子為例：①在含有適當抗生素的瓊脂板上，鋪 一張略小於平板直徑的硝酸纖維素濾膜，使濾膜均勻濕潤,避免產生氣泡,。操作時需戴手套 ，防止手指直接接觸濾膜；②用牙簽將欲篩選的單個細菌菌落轉移(劃線或塗點)至濾膜上 ，同時相應地轉移到另一貯存瓊脂平板上。每個菌落在兩個平板上的位置應該相同。並做好標記，以便雜交後尋找陽性菌落。最後在濾膜上特定位置接種一個非重組質粒菌落作為陰性 對照；③倒置平板,37℃培養,使菌落長至05～10mm直徑;④取3隻直徑比濾膜大的平 皿(如有多張硝酸纖維素濾膜，可改用方盤等容器)，分別放入二張直徑稍小的園形濾紙；⑤分別加入A：05mol/L NaOH, 15 m ol/L NaCl; B:15mol/L NaCl, 05mol/L Tris•HCl(pH74);C:2倍SSC，濕透濾紙，倒 掉多 餘液體(濾紙過濕，菌落在裂解過程中會脹大並擴散，從而影響雜交信號);⑥用平頭鑷取 出長有菌落的濾膜，菌落麵朝上依次放於A、B、C三種液體濕潤的濾紙上，各放5分鍾;⑦ 將處理好的濾膜放於一張幹燥的濾紙上,室溫幹燥30～60分鍾後,將濾膜夾在兩張幹濾紙之間 ,再用二塊玻璃板夾好,放80℃幹烤2小時,固定濾膜上的DNA;⑧進行雜交檢測,方法見核酸 雜交技術。最後再小量提取原位雜交陽性菌落中的重組子,用酶切分析鑒定重組子的正確性。 20倍SSC: 3mol／L NaCl,03mol／L檸檬酸鈉,pH76。(5)小量提取質粒DNA進行酶切分析:由於體外DNA重組是按設計進行的,所以在用上述方 法初步鑒定重組子以後,可以小量提取質粒,按設計要求,用酶切分析方法對重組子的正確性 加以驗證。①用牙簽挑取重組子菌落於3ml含適當抗生素的LB培養液中,37℃振蕩培養過 夜;②取出15ml菌液於小離心管中,12 000r/min離心1分鍾;③完全吸幹上清;④將細菌沉澱完全分散於100μl冰預冷的滅菌懸浮液中(50mmol／L葡萄糖,25mmol／L Tris•HCl pH80,10mmol／L EDTA pH80);⑤加入200μl新配製的裂解液(02mol／L NaOH,1％ SDS)迅速顛倒混勻(不要振蕩),冰浴5分鍾;⑥加150μl預冷的5mol／L乙酸鉀,冰浴中和1 0分鍾;⑦15 000r/min離心5分鍾,將上清移置另一離心管;⑧酚／仿抽提,乙醇沉澱,離 心,幹燥,DNA沉澱溶於20μl滅菌水;⑨取少量質粒DNA,用適當酶切割後電泳,分析 結果。
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