病毒基因探針的製備

 選擇病毒基因序列作為探針時,首先要考慮所選定的探針是否具有高度特異性,換句話說, 作為探針的核酸片段必須含有病毒獨特的核酸序列;其次應考慮探針來源是否方便,探針通 常來源於重組質粒中已克隆的病毒DNA片段,這樣易於大量製備。一般來說,探針的大小在1～ 3Kb左右,如小於05Kb,可能難以大量製備,而且標記率不高;反之,片段過大(大於3Kb),則容 易出現非特異雜交。  (一) 病毒基因探針的種類 根椐來源及 性質，病毒基因探針可分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和化學合成的寡聚核苷酸探 針等幾類。試驗者可根據需要和實驗條件來選擇使用這些探針。 1、基因組DNA探 針 對於雙鏈DNA病毒，可用限製性內切酶切割其基因組DNA，克隆其中一個片段作為 探針材料。這一片段應該最具有該病毒的特點，代表該病毒最特異的基因序列。應用這種特 異探針所取得的雜交結果是最真實可靠的。對於單鏈DNA病毒，其基因組DNA不能被限製性內切酶切割，所以難以克隆特異片段。製備這類病毒的探針時，一般首先使用DNA聚合酶，製備其雙鏈DNA，或者提取感染細胞中的複製型雙鏈DNA，用適當內切酶切割後，克隆特異片段製備探針。 2、cDNA探針 製備單鏈或雙鏈RNA病毒的探針時，一般先對病毒RNA進行反轉錄,合成該病毒的cDNA ，然後克隆特異cDNA片段作為探針材料。  3、RNA探針 應用RNA探針進行分子雜交是較為理想的。因為：①RNA／RNA 或RNA／DNA雜交體比 DNA／DNA雜交體更穩定，雜交反應可在更嚴格的條件下進行，因而雜交的特異性更高，結果更可靠；②RNA探針為單鏈，不存在互補雙鏈的競爭結合，其與待測 核酸的雜交效率更高；③雜交後，可用RNase將未雜交的探針RNA消化掉，從而使本底降低。 RNA探針大多是通過基因組DNA或cDNA克隆經體外轉錄而獲得的。  4、寡聚核苷酸探針 根椐病毒的特異序列,於DNA合成儀上化學合成一段單 鏈寡聚核苷酸,即可作為探針使用。其優點是容易製備,可根椐需要隨意合成任何序列 ,在合成時就可以加入帶有標記物的某一種dNTP,因此片段合成後勿需另外標記,純化後即可 直接進行雜交。這類探針較短,長度一般不超過50nt,所以它所帶的標記物相對較少,其靈敏 度也較低。  (二) 病毒基因探針的標記因標記物的不同,基 因探針的標記方法可分為放射性標記法和非放射性標記法。無論是DNA探針還是RNA探針,均可用這兩種方法標記。根椐標記的部位,放射性標記可分為核酸片段內標記和末端標記。分 述如下: 1、DNA探針放射性標記法用於診斷的雜交實驗，通常使用片段 內標記法製備的探針。末端標記法製備的探針,由於是由均一片段組成的,所以通常用作S1 核酸酶作圖和DNA測序。在此主要介紹片段內標記法,它包括:(1)缺口翻譯:其原理是用微量的DNase I在雙鏈DNA上隨機形成單鏈切口,然後利用大腸杆菌DNA聚合酶I的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中去。大腸杆菌DNA聚合酶I( E.coli  DNA polymerase I)具有兩種活性:a.在缺口處從DNA5向3末端水解單鏈DN A;b.以一條DNA鏈為模板,從DNA5向3末端合成新的單鏈DNA片段。如果在DNA聚合酶處理 探針DNA片段的同時,加入α32P標記的dATP或dCTP和其它3種非標記堿基,32P 標記的堿基則可以摻入到新合成的DNA鏈中去,產生32P標記的放射性DNA片段。具體操 作方法如下:①用適當的內切酶從重組質粒中切下探針DNA片段,經普通瓊脂糖電泳分離後 回收探針該片段;②取05～1μg探針DNA片段,加入25μl 10倍缺口翻譯緩衝液(05 m o l/L Tris•HCl, 01mol/L MgSO4,1 mmol/L DTT,500μg／ml牛血清白蛋白組份V,pH75 ), 未標記dCTP、dGTP、dTTP各20nmol/L、50～100μCi α32PdATP,加水至25μl; ③用缺口翻譯緩衝液加50％甘油,將胰DNase I稀釋至10ng／ml,置－20℃冰箱備用;④ 加入25μl稀釋的DNase I,混合,室溫作用1分鍾,使DNase I在DNA雙鏈上水解出單鏈“缺口 ”;⑤加入25單位大腸杆菌DNA聚合酶I,混合;⑥置1 6℃水浴1小時;⑦加入1μl 05 mol/L EDTA終止反應;⑧標記探針直接可用於雜交檢測。也可將標記探針通過Sephadex G25或50層析柱,分離純化標記探針,去除遊離的α32PdATP。缺口翻譯標記的探針為單鏈DNA片段。應特別注意這種探針是不同分子量單鏈DNA的混合物。標記反應中,DNase I的濃度一定要適當，過高的濃度產生過多的缺口，從而使探針長度 過短，影響雜交效率；過低的濃度可因缺口產生過少而使標記效率下降。缺口翻譯製備的探針可用於原位雜交、Southern和Northern 打點雜交，但不能用於S1核酸酶作圖。它的 優點是可以對同一張硝酸纖維膜進行不同探針的多次雜交。我們曾用同一張膜進行過6次不 同探針的雜交。每次雜交後隻需將膜放入2倍SSC煮沸兩次，每次十分鍾，即可基本消除雜交 的探針，而不影響吸附在膜上的病毒DNA片段。這一優點特別適用於分子量相似的病毒DNA片 段的檢測。(2)隨機引物法(random priming):在待標記的探針DNA變性後加入隨機引物( 常用化學合成的六核苷酸寡聚物)，在隨機引物的引導下和大腸杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段的催 化下合成探針鏈。在合成過程中，加入放射性或非放射性標記的dNTP進行標記。標記方法如 下：①取一微量離心管，依次加入下列試劑： 5倍標記緩衝液  10μl dATP,dTTP,dGTP混合物 各20μmol／L 變性的待標記DNA模板 25ng  1mg/ml牛血清白蛋白 2μl  α32PdCTP 50μCi DNA聚合酶Ⅰ 大 片段 5單位 加滅菌去離子水至50μl ②混勻，離心,室溫反應至少1小時 。為了提高標記效率，可室溫反應過夜;③100℃煮沸2分鍾終止反應，置冰浴，加入ED TA至20mmol/L終濃度;④標記的探針無需進一步純化或乙醇沉澱，可直接用於雜交反應 。 5倍標記緩衝液： 250mmol/L Tris•HCl,pH8 025mmol/L MgCl210mmol/L 二巰基蘇糖醇(DTT)1mol/L　HEPES，pH6626A260單位／ml　隨機六核苷酸引物 放射性同位素標記探針的缺點在於製備和 使用時操作者必需接觸到一定劑量的放射性照射，如果防護不當，可能對健康造成一些影響 。另外,32P的半衰期為1429天，標記好的探針在冰箱中存放兩個月後便不能使用。 近年來，人們開發出非放射性探針，以彌補上述缺點。根據我們的經驗,非放射性DNA探針的 靈敏度與32P標記探針接近(但直接顯色法比32P探針的靈敏度低10～100倍)， 製備的探針可以反複使用，在-20℃冰箱中可以保存一年以上。該方法還可以用單鏈DNA為模板製備探針，因此適於製備單鏈和部分單鏈DNA病毒的探針。 2.DNA探針非放射性標記法 該方法的原理與上述的隨機引物法一樣。隻是將同位素標記的dNTP 換成非同位素如地高辛標記的dUTP。用標記的探針與被檢DNA或RNA雜交。加入堿性磷酸酶交聯的抗地高辛抗體與雜交的探針結合，最後加入顯色劑5溴4氯3吲哚磷酸鹽(BCIP )和硝基蘭四氮唑(NBT)直接在硝酸纖維素膜上顯色。目前已有市售的藥盒可供使用，操作 上並不複雜。以德國柏林格公司地高辛DNA標記試劑盒為例，其標記方法如下：①取10 ng～3μg待標記DNA，用酚、氯仿抽提，並用乙醇沉澱，溶於10μl 去離子水中；②95 ℃水浴5分鍾，使模板DNA變性,立即置於冰浴5分鍾；③加入2μl六核苷酸引物，2μl dNTP標記混合液(含地高辛dUTP)，1μl Klenow片段，並加水至20μl；④37℃水浴 過夜(15小時)；⑤加入2μl 02mol/L EDTA(pH80)終止反應；⑥加入25μl 4 mol/L LiCl和75μl無水乙醇，充分混合；⑦置-70℃30分鍾或-20℃2小時沉澱探針DN A；⑧離心沉澱，洗滌,抽幹；⑨將探針DNA溶於50μl TE緩衝液,即可用於雜交。  3、RNA探針標記法RNA探針的製備與標記一般通過體外轉錄進行。即將 探針DNA片段克隆到噬菌體啟動子驅動的轉錄表達載體中，通過啟動子特異的RNA聚合酶的催 化作用，在試管中以探針DNA的一條鏈為模板，轉錄RNA鏈，在轉錄過程中，如加入放射性或 非放射性標記的rNTP(通常用標記的rCTP,rGTP或rUTP)，合成的RNA即可作為探針。轉錄載體中所使用的啟動子是噬菌體的特異啟動子，如SP6，T7，T3等，每一種啟動子被各自 的RNA聚合酶識別。所以應用不同的啟動子就可構建不同類型的轉錄載體。目前這些載體 均已商品化，可根據不同的實驗進行挑選，但轉錄RNA的操作過程基本一樣，隻是注意根據 啟動子類型來選擇RNA聚合酶。如果在一個載體中有二種不同的啟動子,這就構成了成對啟動 子轉錄體係(如T7／SP6,SP6／T3,T7／T3等)，外源DNA片段可插入這二種啟動 子之間，其優點在於可根據實驗需求選擇轉錄正鏈還是負鏈。在轉錄時如果右端的啟動子轉 錄mRNA，那麽左端的啟動子則轉錄與mRNA互補的反義RNA。轉錄質粒構建、模板製備及標準 轉錄過程如下：①將探針DNA片段插入轉錄載體的啟動子，如SP6或T7下遊，構建 轉錄質粒;②用適當的限製性內切酶在插入片段下遊將轉錄質粒線性化;③酚／ 仿抽提，乙醇沉澱，重溶於無菌水中，濃度在02～10μg／μl之間;④室溫下，在一無菌微量離心管中依次加入下列試劑： 5倍轉錄緩衝液 40μl 100mmol／L DTT 20μl RNasin(RNase抑製劑) 20單位 rATP,rGTP和rUTP 混 合物(各25mmol/L) 40μl 100μmol/L rCTP 24μl 線性化模板DNA  10 μl ａ32PrCTP(10mCi/ml) 50μl(50μCi) SP6或T7RNA聚合酶( 15～20u/μl) 10μl 加無菌水至總體積20μl ⑤混合後37～40℃溫育6 0分 鍾；⑥加無RNase的DNase，1u/μg DNA；⑦37℃溫育15分鍾，消化模板DNA；⑧酚／ 仿抽提，乙醇沉澱，RNA探針重懸於滅菌TE，置－70℃保存備用。 5倍轉錄緩 衝液：  200mmol/L Tris•HCl,pH7530mmol/L MgCl2 10mmol/L 亞精胺(spermidine)50mmol/L NaCl 由於轉錄的RNA探針是單 鏈，極易降解。因此在轉錄、純化及隨後的雜交操作過程中，要特別注意防止RNase的汙染( 詳見病毒RNA提取)。

 

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