核酸雜交技術是分子生物學的基本技術之一,近年來正逐漸用於病毒病的特異、敏感和快速 診斷。雜交的基本原理是堿基互補的二條單鏈核酸退火形成雙鏈。用於診斷目的的雜交雙方是已知序列的病毒探針和待測樣品中的病毒核酸,雜交後通過特定方法檢測。如有雜交信號, 則說明樣品中存在病毒核酸,進而證明病毒感染的存在。待測的病毒核酸可以從病料中提取,也可以從純化的病毒粒子提取。提取後可在膜上與探針雜交(固相雜交)。或直接在試管 的雜交液中雜交(液相雜交),此外, 也可直接在組織切片或細胞塗片上對細胞中的病毒核酸 進行雜交(原位雜交)。下麵重點介紹如何建立雜交體係及適用於病毒診斷的幾種雜交方法。 (一) 建立雜交體係 核酸雜交是多種環境因素與二條互補 核酸鏈綜合作用的結果,它有較高的技術要求。了解各種組份及反應條件對雜交的影響是建立雜交體係,獲得理想結果的基礎。 1、溫度 雜交反應中,雙鏈核酸的變 性與複性主要是溫度控製的。選擇適當的雜交和洗膜溫度是實驗成敗最關鍵的因素之一。雜 交反應通常在低於解鏈溫度(Tm值)15～25℃的條件下進行。Tm值受核酸鏈組成(G+C) 、溶液的離子強度、pH值及反應體係是否含變性劑等的影響。在雜交體係不含變性劑的情況 下,DNA之間的雜交反應通常在68℃進行,當含50%變性劑甲酰胺, 則在42℃進行。 2、pH值雜交體係的pH在5～9的範圍內對複性無明顯影響。雜交反應通常在pH65 ～ 75之間進行。較高的pH值產生更嚴格的雜交條件。 3、鹽離子濃度 體 係 中往往加入單價離子的鹽,因為單價陽離子與核酸鏈上的磷酸基團發生靜電反應,所以能降低 核酸鏈之間的靜電排斥,維持雙鏈DNA的穩定性。鹽濃度增加,穩定性提高。雜交體係中通常 采用6倍SSC(1倍SSC為015 mol/L NaCl和0015mol/L檸檬酸鈉，pH70)緩衝液。 4、變性劑 雜交體係中加入變性劑可降低Tm值,所以雜交可在更低的溫度下進行 。常用變性劑是甲酰胺。 5、DNA濃度 濃度愈高,複性速度愈快。所以雜交反應中應加入足夠的探針,還應盡量減少雜交體積,一般每百cm2濾膜用25ml雜交液。 6、探針長度 溶液中DNA複性率與片段長度的平方根成正比。所以用長的 探針可獲得高的複性率。但原位雜交通常用較短的探針,以減少探針進入細胞並擴散到 靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖 在水溶液中,此化合物表麵可吸附DNA 探針分子,從而濃縮探針,促進二條核酸鏈間的締合。其10%的濃度可提高雜交速度10～100倍 。使用硫酸葡聚糖可能導致背景加深,所以一般在探針濃度過低的情況下才使用。 8、雜交時間 它受探針的長度與濃度、反應體積等因素的影響,較短的探針、較高 的探針濃度和較小的雜交體積,需要較短的雜交時間。一般來說,雜交時間通常在2～16小時。 9、預雜交 在雜交前進行預雜交,封閉非特異的DNA結合位點,降低非特 異雜交,是雜交的前提。常用的封阻試劑有非特異性的DNA(鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脫脂奶粉等)。 10、堿基 錯配 雜交中堿基錯配將明顯提高雜交本底,從而影響雜交結果的判定。因此雜交可在更為嚴格的條件下進行,如低於Tm值15℃的溫度下雜交。 11、漂洗 雜交後的漂洗是減少非特異雜交,降低本底的關鍵步驟。通常用較低鹽濃度(01倍SSC)的緩 衝液在較高溫度下(如68℃)漂洗雜交膜。 (二) 核酸打點雜交 1、操作步驟 核酸打點雜交是最常用的一種雜交檢測方法,是作為診斷 目的的首選方法。它是將一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打點在固相支持膜(通常是硝酸纖維 素膜或尼龍膜)上,然後與放射性或非放射性標記的(DNA或RNA)探針進行雜交,雜交後通過放 射自顯影(檢測放射性探針)或顯色反應(檢測非放射性探針)檢測雜交信號。陽性雜交信號表 明病毒核酸的存在,檢測出病毒核酸就充分說明發生了病毒感染。具體操作方法如下:①裁剪一張大小適度的硝酸纖維素膜(NC膜),將膜在去離子水中濕透(不能完全濕透的膜不 宜使用),再置20倍SSC中浸泡30分鍾,然後置濾紙上,室溫晾幹; ②取變性的病毒核酸(DNA或RNA)1～5μl點樣於上述處理的NC膜上,同時點上探針同源核 酸(作為陽性對照)和非同源核酸(作為陰性對照);③室溫幹燥後,將點樣的NC膜置80℃幹 烤固定2小時;④點樣膜用6倍SSC,01%十二烷基肌氨酸鈉,002%SDS, 1%封阻試劑(一種 特殊提純和處理的脫脂牛奶粉,柏林格公司生產)的預雜交液於68℃預雜交4～6小時。每100c m2膜用至少20ml預雜交液;⑤將膜用雜交液(預雜交液中加入20～80ng/ml變性的探針) 於68℃雜交12～16小時。每100cm2膜用25ml雜交液;⑥室溫下用2倍SSC,01%SDS溶液洗膜2次,在68℃條件下用01倍SSC,01%SDS溶液洗膜2次,每次15分鍾;⑦如果進行放 射 自顯影,則在室溫下用01倍SSC洗膜一次,室溫幹燥後,進行放射自顯影;如果進行化學顯色, 則進行如下操作(以地高辛顯色為例);⑧用100 mmol/L Tris•HCl,pH75, 150mmol/L NaCl短暫洗滌膜;⑨100cm2的膜在20ml抗體結合物溶液中室溫反應30分鍾;10 重複⑧的洗滌二次,每次15分鍾;11膜在100mmol/L Tris•HCl,pH95, 100mmol/L N aCl,50mmol/L MgCl2中平衡2分鍾後,加入顯色液,於黑暗中顯色,當要求的點顯出顏色時, 可用TE洗膜,終止反應。 2、操作說明 (1)從感染的動物組織、血液、分泌物、糞便等樣品中提取的核酸經變性後可直接點在NC膜上,檢測可能含有的病毒核酸; (2)點樣量不超過5μl,如果樣品中核酸含量很低,可在上一次點樣幹燥後在同一點重複點 樣。也可用多孔抽濾加樣器進行點樣,其點樣量可達200μl以上;(3)除NC膜外,也可用尼 龍膜載樣;(4)樣品或探針是RNA時,所有試劑及用品均應進行無RNase處理,而且操作要嚴 格,雜交後可以不必如此要求;(5)預雜交液的配方多種多樣。作者經驗表明,上述預雜交 液容易配製,可用於放射性和非放射性標記的DNA探針雜交。 (三) 核 酸酶保護分析法 該方法是近年來發展起來的一種新的RNA檢測方法。它基於一種 液相雜交方法,即被檢測RNA鏈與均一分子的單鏈探針(放射性標記)在試管中進行雜交,然後 用適當的單鏈核酸酶(S1核酸酶,RNA酶A和T1)水解掉未雜交的單鏈核酸,電泳分離後,通過放射自顯影檢測未被水解(被保護)的雙鏈雜交體。與Northern分析法相比,核酸酶保護分 析法不需要固相支持膜,所以操作簡便,雜交質量也不受RNA轉移效率和洗膜條件的影響,而且 信/噪比大大提高,其檢測的靈敏度比前者提高10倍以上。此外,還能精確定量被檢RNA。核酸酶保護分析法對RNA樣品的純度和完整性要求不高,樣品可以用細胞總RNA,即使輕度降解,也 不影響檢測結果。采用的探針通常是單鏈的、但必須完全均一的DNA或RNA分子。單鏈DNA探針通常采用M13噬菌體係統,摻入同位素標記的一種dNTP來製備,或者采用末端標記來製備。RNA探針一般采用體外轉錄係統,摻入同位素標記的一種rNTP來製備(如前所述)。 1、RNA酶保護分析法(RNase protection assay, RPA) 本方法所采用的探針 是單鏈RNA,它比DNA/RNA雜交體穩定得多。雜交後加入適量RNA酶A 和T1,它們專一性地水解未形成雜交體的單鏈RNA,而探針與被檢RNA雜交後形成的雙鏈RNA則被保護,電泳分離後,通過放射自顯影顯示雜交信號。此方法甚為敏感,可以檢測每個細胞中1～5個RNA拷貝。操作過 程如下:①取5 μl RNA樣品(含量取決於被檢RNA的豐度,可05～150μg),置冰浴;②加 入25μl雜交液(80%去離子化甲酰胺,04 mol/L NaCl, 40 mmol/L PIPES, pH64,1 mmol /L EDTA, pH85)稀釋的同位素標記RNA探針(約1×105 cpm), 混勻並離心;③95℃變 性3 分鍾後立即置42℃～50℃水浴中雜交過夜(12～16 hr);④加入300μl RNA酶消化 液(300mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris•HCl,pH74, 5mmol/L EDTA, pH75, 20μg/ml R NA酶T1, 40μg/ml RNA酶A), 於37℃溫育30分鍾;⑤加20μl 10% SDS,10μl 10mg/m l 蛋白酶K, 於37℃溫育30分鍾;⑥加2μl 10mg/ml 酵母tRNA;⑦酚/氯仿抽提,乙醇沉澱,用10μl電泳上樣液(80%甲酰胺,10mmol/L EDTA, pH80, 01%二甲苯蘭FF, 01%溴酚蘭)溶解;⑧95℃變性3～5分鍾,立即冰浴。於適當濃度的8mol/L尿素變性聚丙 烯酰胺凝膠中電泳分離。最後放射自顯影,判定結果。 2、S1核酸酶保護分析法 此方法類似於RPA,隻是所用的探針是單鏈DNA(一般不用雙鏈DNA探針);所用的酶是S 1核酸酶,它能降解單鏈DNA或RNA,而RNA/DNA雜交體則被保護,操作過程如下:①取05～ 150ng樣品RNA,乙醇沉澱後,重溶於30μl雜交液(見RPA);②加入1×105cpm單鏈DNA探針 ;④95℃變性3分鍾,立即置52℃水浴過夜;③加入300μl冰預冷的S1核酸酶溶液(02 8mol/L NaCl, 005mol/L 乙酸鈉,pH45, 45mmol/L ZnSO4, 1000單位/ml S1核酸 酶 ),37℃水浴30分鍾;⑤加入75μl終止液(25mol/L乙酸胺, 50mmol/L EDTA), 2μl 10mg/ ml 酵母RNA;⑥乙醇沉澱,用10μl上述電泳上樣液溶解, 95℃變性3分鍾,立即冰浴; ⑦如上述電泳和放射自顯影。 (四) 核酸原位雜交所謂 原位雜交,就是保持組織與細胞形態的完整性,用核酸探針直接檢測細胞內的靶核酸序列。它可以檢測和精確定位胞漿內或細胞器上,胞核內或染色體上的各種靶核酸序列。該方法不需 要從組織細胞中提取核酸,對細胞中含量極低的靶序列有較高的敏感性。原位雜交是可以用於病毒感染檢測的另一方法。它能檢測細胞中病毒核酸的複製與表達以及病毒的傳播,並對細胞中的病毒核酸進行定位;它能鑒定感染細胞中病毒基因的整合以及染色體上的整合位點。應用該方法,還能檢測持續感染個體中何種組織含有病毒。除了必須對組織細胞進行固定,以保持原來的形態外,原位雜交與普通雜交方法沒有大的區別 。對組織細胞固定的好壞直接影響雜交的效果,所以用於核酸原位雜交的固定液必須:①理化 性質穩定;②能很好保持細胞形態的完整;③對核酸無修飾和降解作用,並維持其在細胞內的 定位;④不阻礙探針與靶核酸的雜交,不引起雜交本底過高。符合此條件的理想的固定液有10 %甲醛、4%多聚甲醛、戊二醛和乙醇/冰乙酸(3∶1)等,其中4%多聚甲醛最為常用。病毒單鏈 RNA原位雜交的基本方法如下:①將組織切片附於清潔的無核酸酶汙染的載玻片上,或取2 ～3滴分散的細胞懸液直接滴於載玻片上,室溫幹燥;②用4%新鮮配製的多聚甲醛(PBS配 )室溫下固定20分鍾,PBS洗二次;③不同濃度(30%,60%,80%,95%,100%)乙醇梯度脫水,切 片或塗片置於100%乙醇中,-20℃保存備用;④用1μg/ml蛋白酶K(溶於01mol/L Tris•HC l, pH80,50mmol/L EDTA), 於37℃消化30分鍾,滅菌去離子水洗滌;⑤根據探針和被檢核 酸性質,選擇適當的預雜交液,在選定溫度下預雜交30分鍾;⑥然後加入雜交液10～100 μl(含同位素或非同位素標記的DNA、RNA或寡核苷酸探針),雜交12～16小時;⑦用適當 的緩衝液洗滌;⑧於切片或塗片上鋪以感光乳膠,進行放射自顯影,或者用免疫酶法進行 顯色反應;⑨顯微鏡下觀察結果。原位雜交檢測病毒雙鏈DNA時,第(3)步後用RNA酶去掉細胞中的RNA,降低本底。第(4)步後用 乙醇脫水,置70mmol/L NaOH變性3分鍾,衝洗,再脫水,最後進行預雜交和雜交。
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