PCR的全稱是聚合酶鏈式反應(polymeras e chain reaction),它是由Kary Mullis於1987年發明的。1976年人們發現 了一種特殊的DNA聚合酶,它可以耐受94℃高溫而不失活。1985年Saiki等人發現用聚合酶Kle now大片段催化25次DNA聚合反應(由於此酶不耐高溫,所以每次反應需加入新的Klenow片段) 可以將原有的DNA量特異地增大數百萬倍。將上述兩個實驗合並在一起,用抗高溫的DNA聚合 酶( Taq 或 Vent )代替Klenow片段就形成了 目前廣泛應用的具有高度敏感性的DNA PCR擴增技術。根據被擴增DNA片段的序列,人工合成 兩端各約15～30堿基的單鏈DNA引物。取極微量的模板DNA,加入 Taq 或 Vent DNA聚合酶,A、C、G、T四種脫氧單核苷酸以及兩端的DNA引 物,置於PCR擴增儀上即可以進行DNA擴增。一次PCR循環,包括變性→退火→延伸三個過程,通 常使用三個可調溫度及時間:①DNA變性溫度(一般為94℃)及時間,在此溫度下模板DNA的雙 鏈分開;②退火溫度及時間,這個溫度可以根據DNA引物的長度和G+C含量計算出來,一般在4 2℃～62℃之間。退火處理後,DNA引物互補雜交到變性的DNA模板上;③聚合酶延伸反應溫 度多為72℃,反應時間隨被擴增片段的長度而定,一般每合成1 000個堿基需要30~60秒和1單 位 Taq DNA聚合酶。如合成5kb片段,延伸反應時間應為5分鍾,並使 用5單位 Taq DNA聚合酶(反應體積 為100μl)。有時PCR使用雙溫循環,即92～94℃變性→68℃退火和延伸。理論上,每循環一次 ,模板DNA量擴大一倍,所以模板DNA的量是按2n指數冪進行擴增的,n代表PCR次數。如模板D NA數為1,PCR循環25次後,模板數將增至225,即33 554 432, 但在實際操作中,擴增效 率往往低於理論值。這是因為DNA引物經多次循環後被消耗,在下一次循環時,沒有足夠濃度 的引物與模板退火雜交。此外,多次高溫處理後, Taq DNA聚合酶活 性也會下降。即使這樣,PCR也可在數小時之內對僅有的幾個拷貝的基因放大數百萬倍,使其 在凝膠電泳後形成明顯可見的DNA帶。這是PCR技術正逐步用於臨床病毒檢測的最重要原因。 另一方麵,很高的合成效率使得PCR容易出現非特異性擴增,所以要獲得預想的結果,必須選好 欲擴增片段在基因組上的位置,設計特異的引物序列,優化PCR反應的各種條件和選定適當的 循環參數。 (一) 診斷PCR技術的設計戰略 1、擴增片段的確定 為了獲得特異的擴增,僅僅知道被檢病毒的基因序列是不夠的,必須選擇病毒基因組上具有獨特結構的基因區域進行PCR擴增,這一 區域在序列組成或長度上,無論與較近親緣關係還是較遠親緣關係的其他病毒應有明顯的區別。 2、引物設計 引物是影響PCR擴增效率和特異性的關鍵因素。作為診斷PCR,選擇引物應遵循一些基本原則:①引物長度以15～30nt為宜;②正義、反義二條引物鏈間的距離適中,一般使擴增出的片段在300～1 000bp之間,如果用反轉錄-PCR檢測RNA病毒, 引物間距離控製在500bp左右最佳。片段過短則影響電泳結果判定,過長則不易擴增;③引物 堿基組成應隨機分布,G+C含量在45%～55%左右為宜;④引物自身不形成二級結構,引物間不應 有互補序列(4個堿基以上);⑤引物序列必須是被檢病毒特異的;⑥原則上引物3末端堿基與 模板DNA一定要配對,此外3末端堿基最好選T、C或G, 而不選A。 3、PCR緩衝 液 PCR反應標準緩衝液應含:50 mmol/L KCl, 10mmol/L Tris•HCl(pH83),15mm ol/L MgCl2和100μg/ml明膠或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg2+濃度變化明顯影響反應的特異性和擴增效率。Mg2+過多則導致非特異擴增產物增加;Mg2+不 足則擴增效率降低。為了取得最佳擴增效果,可先行預實驗,以確定最佳Mg2+濃度。 4、引物量 PCR反應中所用引物濃度通常在01～05 μmol/L之間。濃度 過 高將出現非特異片段的擴增,過低則不能擴增出足夠的特異帶,最佳用量可以通過係列濃度實 驗來確定。 5、dNTP dNTP(dATP,dTTP,dCTP和dGTP)溶液的pH值應調至70 。在標準PCR反應中,每一種dNTP的使用濃度為50～200 μmol/L(足夠產生7～25μg DNA),更 高濃度dNTP將導致錯誤摻入,從而影響擴增序列的真實性。 6、 Ta q DNA聚合酶 PCR反應中,該酶的用量,通常是25單位。加酶 量過多將導致非特異性片段的擴增。 7 、變性劑 反應中加入適量變性劑(如二甲亞碸、尿素、甲酰胺等)可減少模板的二級 結構,提高反應的特異性。我們在用PCR擴增豬瘟病毒cDNA片段的反應中,加入5%甲酰胺,不但 提高了反應的特異性,而且目的cDNA片段的產量大大提高。 8、循環參數 用3種不同溫度處理樣品,使之變性,退火和延伸,就可進行PCR循環。PCR操作可於三個不同溫度的水浴鍋內手動完成,或者於PCR循環儀上自動完成。變性是循環的第一步,變性不完全,擴 增明顯受到影響,變性溫度太高或時間太長, Taq DNA酶的壽命受到影 響,使得循環次數明顯減少。絕大多數PCR變性溫度在92～94℃之間,時間通常控製在40秒左 右;退火是循環的第二步,退火溫度的選擇決定著引物與模板互補結合的效率和特異性,是PCR 能否成功的關鍵因素。選擇適當的退火溫度,取決於引物的長度、G+C含量、模板的純度和豐 度。較高的退火溫度可 提高引物與模板配對的特異性,從而提高反應的特異性。就含量和純度較高的模板而論,對於 G+C含量在50%左右的約20nt長的引物,55℃是常用的退火溫度。如果引物較短(12～15nt)退 火溫度可降至40～45℃。對於豐度極低的模板的PCR,特別是稀有RNA模板的反轉錄PCR(RT PCR),在最初的1～5個循環可以用更低的退火溫度,然後再行正常的退火溫度,這樣能明 顯提高PCR的成功率。我們在豬瘟病毒和犬瘟熱病毒基因組RT PCR擴增中,第一次循 環的退火溫度用37℃,從第二次循環開始改為50℃退火,成功地擴增出了常規退火溫度下沒 能擴增出的特異cDNA片段。無論什麽樣的退火溫度,時間通常控製在50秒左右。循環的最後 一步是延伸,由於 Taq DNA聚合酶隻有在高溫下才能發揮最大活性, 所以延伸在70～75℃溫度下 (通常在72℃)進行,但延伸反應的時間隨欲擴增片段長度的增加而適當延長。一般來說,每擴 增1kb 的片段,用1分鍾時間是足夠的。溫度及時間確定以後,PCR循環次數主要取決於模板量。但循 環次數通常選定在25～30次,經過這些次數循環後,PCR產物的累積即可達到電泳後肉眼可見程度。除非模板濃度極低,如隻含一個拷貝,循環可增加至40次。目前雙溫PCR正逐漸 被采用,其特點是退火與延伸在一個溫度下進行,這一溫度通常在68℃左右。雙溫PCR大大簡 化了操作程序，縮短了操作時間，同時明顯提高了反應的特異性。 ( 二) PCR反應的一般程序 ①按以下程序,將各成份依次加入05ml PCR反應管： 10倍標準PCR緩衝液 10μl 4種dNTP混合物,每種濃度為125 mmol/ L 16μl 正向引物 100pmol或05μg左右 反向引物 100pmol或05μg左 右 被檢DNA樣品取決於靶序列含量,可達2μg 加滅菌去離子水 至終體積100μl 石蠟油 20μl ②92～94℃變性5分鍾;③置選定的退火溫度，加入25單位 Taq DNA聚合酶(置退火溫度以下,引物與模板可能出現許多非特異雜交,此時加入酶就可能有非 特異鏈的合成,最終導致非特異帶擴增);④置PCR儀或水浴鍋,用選定的變性、退火和延伸溫度及時間,進行25～40次自動或手動循環反應,最後一個延伸溫度保溫5～10分鍾;⑤ 取5～10μl反應液進行瓊脂糖凝膠電泳、觀察、拍照和記錄。 10倍標準PCR緩衝液 : 500mmol/L KCl,100mmol/L Tris•HCl(pH83,室溫),15mmol/L MgCl2, 01％明膠或乙酰化BSA 由於不同的反應條件,PCR合成 的DNA片段中堿基序列可能會有03%～05％的誤差,因此,如果需要克隆PCR片段,製備點突變或缺失突變株時,最好使用 Vent DNA聚合酶。該酶具有校對錯誤 堿基的功能(proof reading activity),它可以從5末端向3末端合成DNA,也可以從3末 端向5末端校對並水解掉錯配的堿基,因此合成誤差比 Taq DNA聚 合酶小得多。不過,在診斷上,這樣的誤差一般不會影響最終結果。 (三) PCR用於DNA病毒的檢測 無論單鏈或雙鏈病毒DNA，均可用PCR進行檢測。檢測樣品可以是純化DNA,也可以是細胞 、組織及任何可能含有病毒的樣品。一般無需提取DNA,可直接取少量樣品(少於10μl),煮沸 變性10分鍾後進行PCR測定。如前所述,PCR檢測需要兩個特異的DNA引物,引物之間的距離(決 定擴增DNA片段的長度)控製在03～1kb之間最佳。如果擴增片段達2～5kb,PCR反應產物在 隨後的電泳中,可能出現多條DNA帶,這時往往需要用Southern 轉移雜交來鑒定哪一條是病毒 特異的帶。為了盡量減少PCR的非特異反應,可進行如下調整。1、增加DNA引物的長度。一般引物長15～20堿基,但可以增加到25～30堿基;2、引物加長後,提高退火溫度,增加反應的特異性;3、選擇其它DNA序列重新合成特異的DNA引物;4、如果病毒的序列來源於cDNA ,則應考慮到某些病毒DNA上含有內含子,可能使被擴增的片段遠遠大於原設計,甚至無法 得到這樣大的片段。 (四) PCR用於RNA病毒的檢測 由於 Taq 或 Vent DNA聚合酶不能以RNA為模板合成 cDNA,所以不能對RNA病毒核酸進行直接PCR。首先必需提取病毒RNA,加入反轉錄酶合成cDNA, 然後才能進行PCR擴增。因此必需進行兩步反應(反轉錄酶不耐熱)。這就是所謂的反轉錄-PC R(RT PCR)。病毒RNA可以從各種適合的組織 器官、排泄物、分泌物或細胞培養物中提取,這取決於被檢病毒的種類。RTPCR同樣具有很高的敏感性。作者從100μl豬瘟兔化弱毒的犢牛睾丸細胞培養物中提取了病毒RNA,用 下述RT PCR方法,從中擴增出了特異cDNA片段。 第一步： 反轉錄合成第一鏈cDNA:①取一反應管，分別加入：病毒RNA（或感染細胞總RNA） 適量 10倍標準PCR緩衝液 5μl 25mmol/L dNTP 5μl正向引物 05μg反向引物 05μg RNasin 40單位 反轉錄酶(AMV) 10單位 去離子水 至終體積50μl②42℃水浴1小時。 第二步： PCR擴增:③將上述反應物煮沸變性5分鍾，立即冰浴；④加Taq DNA聚合酶2單位；⑤置PCR儀,用選定的變性、退火和延伸溫度及時間，進行30～40次循環反應；⑥取5～10μl反應產物,進行電泳、觀察、拍照和記錄。反轉錄反應中，用PCR緩衝液代替反轉錄緩衝液，同時加入正、反向引物,既簡化操作步驟 ，又不影響反應效率。應用該方法，我們還成功地從感染細胞總RNA中擴增出了牛病毒 性腹瀉病毒、狂犬病毒、犬瘟熱病毒的特異cDNA片段。1990年人們發現了一種極其耐熱的反轉 錄酶,可以將兩步反應合並在一起,前半部為反轉錄酶合成cDNA,後半部為PCR,隻需適當調整P CR的工作時間及溫度,則可直接得到PCR擴增的cDNA片段。目前已有市售的RT PCR試 劑盒供使用。 (五) PCR用於分子流行病學研究病毒在自然 界中產生自發突變株是長期困擾病毒學工作者的棘手問題。例如流感病毒、牛病毒性腹瀉病 毒、脊髓灰質炎病毒、口蹄疫病毒等都會因地理或生態環境，動物體的內環境(如易感性、 免疫壓力等)，氣侯和時間因素等的變化而自發產生基因突變的變異株,使人或動物的免疫係 統無法正確識別,導致原有的疫苗接種失敗,造成病毒大量傳播。就其本質來說,病毒發生 突變是指病毒基因的缺失、插入、交換和基因點突變等。PCR技術的出現,使人們 有可能大規模、且十分精細地研究病毒突變的規律及突變位點,迅速地鑒定突變株,從分子水 平上闡述病毒病的流行規律,這是目前分子流行病學的主要研究內容之一。在可能發生缺 失 的病毒基因兩側合成DNA引物,進行PCR或RT PCR,通過電泳即可清楚地看到被擴增的片段小於對照株;如果外源基因插入某個位點,用這個位點兩側的DNA引物進行PCR擴增,就可以發現擴增的片段大於對照株。美國科學家用多種因素(化學、物理)處理脊髓灰質炎病毒 ,然後製備cDNA。對混合的cDNA進行PCR,發現了多種不同的突變株。他們還使用PCR研究不同 口蹄疫毒株之間的重組。他們首先在兩個毒株的核酸序列上尋找兩個非同源序列,合成DNA引 物。引物Ⅰ隻能與A株雜交,引物Ⅱ隻能與B株雜交。因此,用這兩個引物不能對A株或B株的cD NA進行擴增。將A、B兩株在不同條件下混合感染單層培養細胞,提取病毒RNA製備cDNA,最後用引物Ⅰ和Ⅱ進行PCR。如果電泳中發現特異的DNA帶,同時此DNA帶能與32P標記的兩 個DNA引物雜交,則說明A、B兩株的基因組RNA在兩個DNA 引物中間的序列發生了基因重組。 用此方法可以迅速準確地測定試驗室內病毒發生基因重組的條件。令人驚奇的是經PCR擴增 後,電泳中往往出現多條分子量不同的帶,核酸序列分析說明A、B兩株間有多個不同的重組位點。有人采用RT PCR技術,對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的基因突變進行了研究, 發現許多致細胞病變BVDV毒株的P80基因區有外源核酸序列的插入(大小約數百個堿基 ),而非致細胞病變毒株則沒有這種插入。當然,PCR結果還難以說明病毒遺傳變異株的穩 定性、毒性、滴度、致病性等多項病毒學指標,然而這些研究結果說明了病毒間基因重組的複雜性和重組的條件,使人們有可能著手研究病毒重組突變機理。
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