基因重組

不同小RNA病毒株間的基因重組研究已經有20多年曆史。近年來由於PCR技術的應用,研究深度和廣度有了明顯的提高。一般認為,自然界病毒基因的變異與病毒的基因重組有一定的關係。病毒重組研究的目的在於了解自然界病毒變異的機理和規律,同時探討在實驗室內製備重組疫苗的可能性。小RNA病毒重組研究往往使用兩個不同的基因標誌株,如溫度變異株(ts株)、殼粒蛋白點突變株等。用兩個毒株同時感染細胞,分離單個病毒蝕斑,挑選病毒克隆,再利用母株的兩個不同基因標誌篩選重組株。已經發現病毒基因重組發生在負鏈合成過程中。部分合成的病毒負鏈RNA與RNA聚合酶一同從原母株正鏈RNA模板上轉移到另一個母株正鏈RNA模板上,繼續完成整條負鏈RNA的合成。由重組的負鏈病毒RNA再合成正鏈RNA,重組正鏈RNA翻譯重組病毒蛋白,再將正鏈RNA裝配到病毒衣殼中,從而產生重組病毒株。根據排列組合推算,病毒RNA包裝過程可以出現多種情況。Pp1、Pp2和Gp1.2分別代表兩個母株衣殼和重組衣殼,PR1、PR2和GR1.2代表兩個母株和重組株RNA。三種病毒RNA都能被包裝進入三種不同的毒株衣殼中,產生9種病毒粒子:PR1+PP1、PR1+PP2、PR1+GP1.2;PR2+PP2、PR2+GP1.2;GR1.2+PP1、GR1.2+PP2、GR1.2+GP1.2。其中隻有GR1.2+GP1.2為真正的重組株。因此必需經過多次蝕斑克隆,才能得到三種病毒株,即PR1+PP1、PR2+PP2、GR1.2+GP1.2。顯然,隻有第三種為重組株。小RNA病毒RNA重組可以在很多位點上發生。脊髓灰質炎病毒重組位點的總堿基數為病毒RNA的12%,口蹄疫病毒為3%,可見重組頻率是相當高的。Kind(1988)通過對重組株與母株的血清型鑒定發現,所有的病毒RNA分子在一個複製周期中可以產生10%～20%的重組RNA(GR1.2)。病毒RNA複製誤差約104/堿基,即平均每條病毒RNA鏈上有一個堿基錯誤。幸而,99%以上的突變RNA不能繼續複製,因此自然界中病毒的變異相對緩慢。已經證明,不僅在實驗室可以製備重組病毒,在自然界同樣可以發現病毒基因重組。從自然界分離的脊髓灰質炎病毒株的核酸序列分析中發現,某些毒株含有所有三種口服疫苗株的核酸片段。可能由於三種疫苗株同時感染腸道中的一個細胞而產生了三個母株間的RNA重組。從小RNA病毒的基因重組和自然點突變的發生率來看,不難理解為什麽小RNA病毒有如此眾多的亞型。隨著病毒的進化、減毒活疫苗的增加和大型集約化飼養的發展趨勢,可能會不斷出現人們從未發現過的新亞型、新型以至於新種、新屬的小RNA病毒。

我們曾對不同屬之間小RNA病毒基因重組進行過較為細致的研究。試驗使用口蹄疫病毒屬的O型口蹄疫病毒株和豬腸道病毒。兩株病毒均可以在IBRS2細胞中複製。口蹄疫O型株可以感染BHK21,但豬腸道病毒則不能。如前所述,口蹄疫病毒在pH62以下迅速失去感染力,而豬腸道病毒在pH3～10卻十分穩定地保持感染能力。試驗首先用口蹄疫病毒和豬腸道病毒對IBRS2細胞進行雙重感染。收集病毒培養液,加01mol/LNaH2PO4調節pH至58,置4℃12小時。試驗證明經pH58處理,口蹄疫病毒被滅活,但不影響豬腸道病毒的感染活性。調節病毒液pH至74,並感染BHK21細胞。經3次傳代,發現具感染活性的病毒存在。豬腸道病毒不能感染BHK21細胞,口蹄疫病毒已經pH58滅活,因此出現的病毒可能是兩母株的重組株。小RNA病毒對低pH的耐受性與殼粒蛋白(VP1、2、3)有關,因此重組位點可能在P1區。重組病毒液經5次蝕斑克隆後得到100個克隆株。抗口蹄疫和抗豬腸道病毒抗體雙重標誌篩選證明,重組株具有兩母株的抗原性。用重組株接種乳鼠,發現其毒力比口蹄疫母株下降10000倍。以未經滅活的重組株接種豬,不能引起口蹄疫,但可以誘導豬產生抗口蹄疫病毒抗體。試驗證明免疫豬可以耐受100ID50劑量的口蹄疫病毒攻擊。由於口蹄疫病毒保護性抗原決定簇位於VP1141～160號氨基酸殘基上,因此重組株可能保留了這部分基因。病毒蛋白SDS電泳顯示重組株的VP1略大於兩母株,並與兩母株的抗體結合(Westernblot),說明重組株VP1可能是口蹄疫和腸道病毒VP1的融合蛋白。重組株VP2、3能與口蹄疫病毒抗體反應,不能與腸道病毒抗體反應,說明RNA重組發生在VP1基因中間：即重組病毒RNA5末端至VP1中部來源於腸道病毒,VP1中部下遊來源於口蹄疫病毒。另外,病毒的細胞膜受體結合位點在VP1203~213氨基酸殘基上,重組株可以感染BHK-21細胞,因此病毒RNA應該保留口蹄疫母株病毒的這段序列。對重組株部分cDNA與兩母株的核酸序列進行分析比較,證明病毒RNA重組確實發生在VP1基因上。

口蹄疫病毒的L蛋白參與抑製宿主蛋白合成反應(水解P220),腸道病毒則由2A蛋白參與這一反應。重組株RNA5末端由腸道病毒RNA取代,不含口蹄疫病毒的L蛋白基因,VP13末端為口蹄疫病毒基因,不含腸道病毒的2A蛋白,這也許是重組株對宿主細胞蛋白合成抑製減弱,對動物毒力降低的原因之一。這個試驗證實在小RNA病毒中,不同屬間也可能發生基因重組,產生新病毒。但重組率可能遠低於同屬病毒間的重組。根據現有的小RNA病毒基因圖譜和病毒蛋白生物活性等資料,可以在實驗室內較為合理地設計重組試驗,準確地發現重組位點以及合理地分析、解釋甚至預測重組株的生物學活性,從而可為病毒疫苗的製備、病毒基因的定位和分子流行病學分析提供更多的研究手段。近年來美國學者使用PCR技術對小RNA病毒重組進行了大量的研究,使人們更加深入地了解重組頻率、位點、條件等多方麵的資料。