黑穗醋栗組織培養和遺傳轉化一
錄入時間:2009-7-1 15:08:49
來源：青島betway必威西汉姆联
摘要：通過對不同激素質量濃度配比實驗，建立黑穗醋栗莖尖高頻再生體係。結果表明，Ms + 6-BA1.0mg/L + NAA 0.1 mg/L，培養基可高效誘導黑穗醋栗莖尖的分化，1 / 2 MS 培養基可快速誘導根的生成，形成再生植株。25 mg/L 卡那黴素可以抑製莖尖的分化，20 mg/L ，卡那黴素可以抑製分化小苗的生根。利用農杆菌介導法將osMAPK4 基因轉化黑穗醋栗，獲得了抗卡那黴素的再生植株。提取轉基因植株基因組DNA ，進行PCR 檢測，結果表明。，MAPK4 基因已經被整合到黑穗醋栗基因組中。
關鍵詞：黑穗醋栗；組織培養；遺傳轉化
黑穗醋栗，又名黑加侖，黑醋栗，黑茶藺子，為虎耳草科茶蕉子屬小灌木，是東北地區廣泛栽培、營養豐富、風味獨特、資源雄厚的北方漿果。其鈣含量為水果之冠，維生素C 的含量比一般水果高出幾十至幾百倍，其含有的類黃酮有延緩衰老、增強人體免疫力、降血脂、改善動脈硬化和防癌抗癌的作用。但黑穗醋栗屬於多年生木本果樹，世代周期長，雜合性高，許多重要經濟性狀屬於多基因控製的數量性狀，遺傳機理不明，利用常規的方法進行品種選育困難重重。利用基因工程手段將外源基因導入作物中，培育出新的品種已成為現代農業和農作物育種的發展方向。但是黑穗醋栗屬於木本果樹，離體培養技術還不完善，再生有困難，常常無法獲得再生植株，並且缺乏高效的遺傳轉化方法。針對以上問題，我們以黑穗醋栗為試材進行組織培養和遺傳轉化的初步研究，以期為黑穗醋栗組織培養和遺傳轉化提供一定的依據。
1 材料和方法
1.l 材料
以黑穗醋栗品種布勞德（Brodtorp）莖尖為轉化的外植體，取自東北農業大學園藝試驗站。實驗使用根癌農杆菌菌株LBA4404 ( Rifr , Kmr ) ，由東北農業大學生命科學學院植物生物工程研究室提供，質粒載體pBME12 含有osMAPK4 基因，PE12 啟動子，及NPTⅡ基因，質粒圖譜見圖1 。
1.2 方法
1.2.1 黑穗醋果莖尖再生體係的建立
采取越冬前至早春萌芽前la 生枝條上的腋芽作為外植體，首先將帶芽莖段用流水衝洗幹淨，然後在超淨工作台上按下列程序消毒：70 ％酒精305 " 0.1 ％升汞15 min 一無菌水衝洗4 一5 次，除去葉芽外層苞片撥取0.2 mm 左右的莖尖。
將莖尖接種於附加不同激素的MS 培養基上誘導萌芽。每處理接種60 個芽，3 次重複，培養30d 後將培養莖尖轉至增殖培養基，待苗高約2 一3 cm 時，再分別轉人生根培養基生根，每處理接種60 個芽，3 次重複。培養溫度為（25 士2 ）℃ ，光照強度2000lx ，每天光照12~ 14h 。
1.2.2 農杆菌介導法對黑穗醋果莖尖的遺傳轉化
將莖尖外植體放於分化培養基上預培養ld ，然後放於轉化用的菌液中，浸泡15~20min。用無菌濾紙吸幹植物材料表麵的菌液，然後轉至MS 固體培養基上，28 ℃ 共培養3d ，共培養pH 值為5.2 。共培養後，用含有拍100 mg/L，阿莫西林的MS 液體培養基衝洗，離心去上清，用無菌濾紙吸幹植物材料表麵液體，轉至含有100 mg/L 阿莫西林的MS 培養基上除菌。每7d 繼代1 次。將除菌2 次以後的植物材料轉至含有100 mg/L阿莫西林的MS 固體培養基上繼續進行轉化篩選及除菌。2 周繼代1 次，並同時誘導抗性植株。對抗性植株進行PCR 檢測，用osMAPK4 基因序列的引物進行PCR 檢測，引物如下：
sense : 5 ' AAGCTYGCCATAGATFCAATYCAATC 3 '
antisense : 5 ' GATCCAAACCAAAGCTTTTTTTCTTTCC3 '
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