2 結果與分析
2.1 黑穗醋栗莖尖再生體係的建立
2.1.1 黑穗醋果莖尖培養基的確定實驗設計了多種用於莖尖分化增殖的培養基，以便篩選出最適合的激素配比。從表1 可以看出，布勞德休眠芽莖尖培養的分化率，在各培養基之間差異不顯著，1 號培養基莖尖增殖係數最高。莖尖在1 號、2 號、7 號和8 號培養基上獲得增殖係數顯著高於其他培養基。在選擇莖尖培養時，要求莖尖在該培養基上具有較高的分化頻率和增殖係數，同時要求所培育的無菌苗生長勢強，並且有較強的生根能力。盡管1 號培養基分化率和增殖係數較高，但得到的分化苗節間較長，生長勢弱，經多次繼代容易玻璃化，並且很難生根。莖尖在7 號和8 號培養基上都具有較高的分化率和增殖係數，而且得到的試管苗長勢較好，容易生根。因為7 號培養基6-BA 質量濃度較低，所以確定黑穗醋栗莖尖分化和增殖最佳培養基為7 號培養基（基本培養基是MS ，蔗糖3 % ，瓊脂0.8 % , pH 5.8 , 6-BA mg/L, NAA 0.l mg/L）。
2.1.2 黑穗醋果生根培養基的確定
取生長健壯的再生植株，切除其基部的愈傷組織，然後接種在生根培養基上，探討適宜的生根培養基（表2 ) , IBA 質量濃度對黑穗醋栗再生苗生根率具有一定的影響。試管苗在1 號和2 號培養基上具有較高的生根率，同其他培養基相比較差異顯著。其原因可能是高濃度IBA 使試管苗基部形成大量愈傷，從而抑製根的形成。2 號培養基IBA 濃度為0.1 mg/L，在試管苗基部也產生了少量愈傷，影響了試管苗的生根質量。1號培養基沒有添加植物生長調節劑，但其仍具有較高的生根率，而且生根質量較好，因此確定黑穗醋栗再生苗生根培養基為l 號培養基（MS / 2 ）。
2.2 黑穗醋栗莖尖培養篩選壓力的確定
2.2.1 卡那黴素對黑穗醋栗莖尖分化的影響
將外植體接種到含卡那黴素質量濃度O 、25 、50 、75 、100 mg/L的芽誘導培養基上進行培養，統計分化結果。根據初篩選結果設置第2 次卡那黴素質量濃度梯度，確定最佳的篩選質量濃度。初步試驗結果表明，Km 質量濃度在25 mg/L時，已完全抑製了莖尖分化。因此，在此基礎上，重新設置質量濃度梯度，分別為：o 、15 、20 、25 、30 mg/L。結果表明，Km 在25 mg/L時，即能完全抑製莖尖的芽再生（表3 ）。因此確定Km 的最適質量濃度為25 mg/L。
2.2.2 Km 對黑穗醋果試管苗生根的影響
將外植體接種到含卡那黴素質量濃度0、25 、50 、75 、100 mg/L的芽誘導培養基上進行培養，統計分化結果。根據初篩選結果設置第2 次卡那黴素質量濃度梯度，確定最佳的篩選質量濃度。初步試驗結果表明，Km 質量濃度在25 mg/L時，已完全抑製試管苗根的發生。因此，在此基礎上，重新設置質量濃度梯度，把Km 設0 、10 、15 、20 、25 mg/L, 5 個質量濃度梯度來探討其對生根率的影響。表4 結果表明Km 在20 mg/L時，即能完全抑製試管苗根的發生。因此確定Km 生根的最適質量濃度為20 mg/L。
2.3 農杆菌介導法轉化黑穗醋栗
共培養3d的莖尖含有100 mg/L阿莫西林的液體培養基除菌後，轉到100 mg/L阿莫西林的固體除菌培養基上，培養15d 後轉到含100 mg/L卡那黴素的篩選培養基上篩選。篩選3 一4 周得到抗性芽，待抗性芽長至2 一3 cm 高時，將其轉至含有卡那黴素的生根培養基上進行2 次篩選，2 周後即可生根，獲得抗性植株。1 500 個外植體共獲得23 個抗性植株，待根係發達後進行馴化移栽。
以質粒PBME12 （含osMAPK4基因）為陽性對照，無菌水為陰性對照，未轉化植株DNA 代替模板DNA 為負對照，以抗性植株總DNA 為模板，用osMAPK4基因序列的引物進行PCR 檢測。隻有4 株抗性植株擴增出與目的基因大小一致的條帶，轉化率為0.27 ％。
從PCR 產物電泳結果圖（圖2 ）可見，選取的抗性苗DNA 經引物擴增後產生與陽性對照相同的約1700bP 的特異擴增帶，與osMAPK4 基因的外源片段大小相符，而非轉基因對照中未見相應擴增帶。這初步說明外源基因已整合進黑穗醋栗的基因組中。
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