輪狀病毒屬（Rotavirus）[HT5K〗 同義名：雙層病毒（Duoviruses） 輪狀病毒是各種幼齡動物非菌性腹瀉的主要病原之一。最早於1968年由 Mebus 等在美國內布拉斯加州一農場犢牛腹瀉病例中發現，歐、美洲各國以及澳大利亞、 新西蘭和日本等都發現了牛輪狀病毒引起的犢牛腹瀉，澳大利亞和英、美等國均報 道有輪狀病毒引起的仔豬腹瀉。此外，在綿羊、山羊、幼駒、鹿以及兔和小鼠等 也有發生輪狀病毒性腹瀉的報道。小鼠的流行性腹瀉就是輪狀病毒引起的。雞 和火雞等多種禽類中亦有輪狀病毒感染的存在。我國亦有豬、牛、羊、犬和多種禽類等輪 狀病毒感染的報道，並已發現或分離鑒定了病毒。輪狀病毒感染引起嚴重的經濟損失。以英國為例，犢牛輪狀病毒性腹瀉的發病率 為60%～80%，死亡率為0%～50%，1%～4周齡仔豬群的發病率超過80%，死亡率7%～20%。輪狀病毒感染引起的腹瀉是一種世界性傳染病。據初步統計，全世界幼兒發生的腸炎至少有 50%是 由輪狀病毒引起的。該屬代表種為人輪狀病毒，其它成員包括從人、牛、小鼠（EDIM）、豚鼠、綿羊、山羊、豬 、猴（SA11）、馬、羚羊、北美野牛（Bison）、鹿、家兔、犬、禽的分離株。
[BT4]1. 形態特征病毒粒子略呈圓形，具有雙層衣殼。直徑為65～75nm。中央為一個電子致密 的六角形核心，直徑37～40nm。周圍繞有一個電子透明層。輪狀病毒曾被描 述為類呼腸孤病毒，但可根據它們清晰明確的光滑外緣與呼腸孤病毒相區別。殼 粒由此向外呈輻射狀排列，構成內衣殼。外周為一層由光滑薄膜構成的外衣殼， 厚約20nm，外衣殼可能是在內質網膜上芽生時獲得的。以核心為轂，以呈輻射狀排列的內 衣殼為輪輻，以外衣殼為輞，構成了特征性的輪狀結構。輪狀病毒這一名稱，就 由此而來。有關輪狀病毒的超微結構，學者們的意見尚不一致。曾提出過內 衣殼有３２個、１３２個、１６２個、１８０個、３２０個殼粒構成呈２０麵 體排列的多種模型。Martin等（1975）認為輪狀病毒與環狀病毒一樣，也有32個大的環形殼粒，且其180個三聯亞單位 按T=9方式組成20個三角麵體。每個三聯亞單位包含3個結構單位，所以一共有540 個結構單位。但據Esparza（1978）報道，輪狀病毒表麵有162個孔，由320個三聯 亞單位按T=9方式組成20個三角麵體。因每個三聯亞單位包含三個結構單位，所 以一共有960個結構單位。[HT5”SS][JZ]圖19-3 輪狀病毒（橫杠=100nm） [CD2]自 楊盛華[HT]出現上述不同的觀察結果，也許是標本製作方法不同的緣故。現公認輪狀病毒為二十麵體，三角剖分數T=13。Stannard等（1977）對乳鼠流行性腹瀉輪狀病毒和猴輪狀病毒SA11株進行了 細致的電子顯微鏡觀察，發現其內衣殼有180個形態亞單位，排列成晶格狀。12個 頂各為一個空隙，由5個殼粒圍繞，另外80個空隙各由6個殼粒圍繞。外衣殼由蜂 窩樣的晶格組成，且與內衣殼的晶格排列相符。 Stannard還繪製了一幅有關 輪狀病毒衣殼結構的模式圖，見圖1９-4。除完整的病毒粒子（稱為光滑型，即S顆粒）外，還常可以見到沒有外衣殼的病毒粒 子，稱為粗糙型，即R顆粒。形成無感染性的或感染性差的單層衣殼殼粒，這種顆粒 ，比完整病毒粒子小，其出現的相 對頻率甚低，但已發生在雞、仔豬、犢牛和人類的感染中，約占仔豬輪狀病毒感染的５％，而在牛則低至１％。此外還有空衣殼。在已感染的小 腸上皮細胞的胞漿內，常有無定形的毒漿（viroplasm）和微管樣結構（其表麵形態 與病毒粒子相同），可能是病毒衣殼異常合成的產物。[HT5”SS][JZ]圖19-4 輪狀病毒衣殼結構模式[JY,16][CD2]自Stannard[HT][BT4]2. 理化學特性輪狀病毒粒子和核心在氯化銫密度梯度中的浮密度分別為136～138g/cm3和144g/cm3。S20w=525。病毒由11個節段的雙鏈RNA組成，大小為06×103～33×103kDa。以Nebraska株輪狀病毒為例，各節段的分子量分別 為221、185、170、155、100、082、051、051、026、0 20和020×103kDa。RNA占病毒粒子重量的12%～15%。短的保守序列全在5′末端。輪狀病毒ＲＮＡ的１１個節段，在聚丙烯酰胺凝膠電泳後，易於分開，形成特定的電泳帶組合模 式，即電泳圖型模式，簡稱電泳型。這１１條帶分為４個區段。常見的動物和 人的輪狀病毒的４個區段中，各帶的排列位置為４∶2∶3∶2，統稱Ａ群。根據 第１０和第１１節段之間距離的長短，又分長型和短型。後來又發現了一些新 的輪狀病毒，其電泳型與Ａ群不同，稱為Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｆ群，見表19-3和 圖19-5。[HT5”H][JZ]表19-3 輪狀病毒分群特征[HT6SS][BG(!][BHDFG2,WK6,K14,K11,K20ZQW]群 群特異性抗原 電 泳 型 [JZ]宿 主[BHDG10]ABCDEF[]ABCDEF[]4∶2∶3∶24∶2∶2∶34∶3∶2∶25∶2∶2∶24∶2∶2∶33∶3∶3∶2[]多種動物和人豬、牛、大鼠、中國成人、小兒小兒、豬禽豬禽[BG)F][HT][HJ]盡管不同的血清型可能呈現相似的電泳型，而同一血清型又可能顯示不同的電 泳型，但國內外迄今還常應用電泳分型法作為鑒定輪狀病毒的主要手段。[HT5”SS][JZ]圖19-5 輪狀病毒RNA的電泳型[HTSS][JZ][WB]A. 常見輪狀病毒，長型，4∶2∶3∶2[DW]B. 常見輪狀病毒，短型，4∶2∶3∶2[DW]C. 非典型輪狀病毒，5∶2∶2∶2[HT]應用聚丙烯酰胺凝膠電泳，可在不同毒株間發現RNA節段的電泳遷移圖譜有一定 程度的差異，不同種動物的輪狀病毒之間的差異更明顯。其中最重要的是根據第10和11 節段之間距離的長短劃分的所謂長型與短型。一些A群輪狀病毒具有血凝性，例如牛NCDV株能凝集人O型以及豚鼠、馬、綿羊等紅細 胞。綿羊和人株能凝集雞、綿羊、兔、豚鼠及人的紅細胞。我國江蘇省的分離株能凝 集豚鼠、馬、人O型、綿羊及犢牛紅細胞。最適pH72～74，溫度為37℃，血細胞濃度 為05%。血凝和血凝抑製試驗亦可提供一種毒株分類方法。輪狀病毒對環境因子和許多常見消毒劑如碘附和次氯酸鹽有較強的抵抗力，能耐 受乙醚、氯仿和去氧膽酸鈉處理而不影響其感染性。對酸（pH30）和胰酶穩定，56 ℃ 30分鍾使其感染力降低2個對數。1mol/L MgCl2 不能增高其對56℃ 60分鍾 的穩定性。糞便中的病毒在18～20℃室溫中，經7個月仍有感染性。能耐1%甲醛1 小時以上。10％聚維酮碘（povidoneiodine）、９５％乙醇和6７％氯胺Ｔ是有效消毒劑。總的說來，蛋 白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增強輪狀病毒和正呼腸孤病毒的感染性，由於輪狀病毒 對外界環境因素及消毒劑作用有抵抗力，所以當清洗和消毒畜禽舍時必須注意到 這個特點。
[BT4]3. 抗原性病毒粒子表麵有３種抗原，即群抗原、中和抗原及血凝素抗原。群抗原與多種 結構蛋白有關，主要是由第6節段編碼的內殼蛋白Vp6；中和抗原主要是由第9節段編碼的外殼糖蛋白Vp7；血凝素抗原是由第4節段 編碼的外殼蛋白Vp4，可被蛋白水解酶水解。不是所有的輪狀病毒都有血凝 素。根據群抗原的差異及病毒RNA末端指紋圖的分析將輪狀病毒分為A～F 6個群。絕大多數哺乳動物輪狀病毒，具有一種相同的群抗原。這些輪狀病毒被命名為A 群或典型輪狀病毒，包括大多數哺乳動物和禽A群輪狀病毒，是研究的主要對象。B～F群隻在原代宿主上生長，為非典型輪狀病毒或副輪狀病毒(pararotavirus），缺乏 共同抗原，其基因片段隻有第5、7、9節段RNA；其中B群出現在人、豬、牛、綿羊和大鼠， 在 我國發現的成人輪狀病毒是重要代表；C群在豬，很少見於人，D群和F群在禽，E群在豬。禽輪狀病毒與哺乳動物無抗原相關性。盡管用免疫熒光、ELISA、補結試驗、瓊擴等方法檢測群抗原，但同群輪狀病毒仍有不 同的抗原。此種抗原可用血清中和試驗或蝕斑減數中和試驗鑒別。根據中和抗 原Vp7的差異可將A群輪狀病毒分為14個血清型，分別用阿拉伯數字G1～11 標記；依據Vp4差異大約有８個血清型，標記為p1～8，它們間有部分抗原交叉。
[BT4]4. 培養盡管最初分離的幾個輪狀病毒株如猴的SA11株、牛的Nebraska株和O株都易在細 胞培養中增殖，但在應用胎腸器官培養以及胎腸單層細胞和胚腎等許多原代或細 胞係單層細胞培養物分離和增殖其它一些輪狀病毒時，如牛、豬和人的輪狀病毒時，都常不易成功或則增殖率不高，或則不易傳代。Banatvala等（1975）將培養有豬腎細胞的蓋玻片置於平底塑料管底，待其長 成單層後，接種嬰兒糞濾液，並以3 000r/min離心沉澱2小時，隨後置37℃培養。24小 時後用熒光抗體染色，發現有陽性熒光細胞，同樣培養接種，但未離心沉澱的細胞 培養物卻呈陰性結果。Bryden等（1977）和Bridger（1981）也證明離心沉澱物可以提高輪狀病毒的陽 性分離率，但仍不能使輪狀病毒在細胞培養物中連續傳代。培養輪狀病毒使用最普遍的是MA104（恒河猴胎腎傳代細胞係），其它敏感細胞尚 有AGMK（原代非洲綠猴腎細胞）、CMK（一種猴的原代腎細胞以及CV1（非洲綠猴 腎細胞係）。火雞和雞等禽輪狀病毒的初次分離也可用雛雞腎或雞胚肝細胞的原 代培養物。某些禽A群輪狀病毒既能夠感染未致敏的禽脾淋巴細胞。又能感染禽 淋巴母細胞轉化細胞係。連續轉動培養有利於分離和複製輪狀病毒。為了在細胞培養中複製輪狀病毒和連續傳代，通常需要用胰蛋白酶處理激活。Clask 等（1981）建議病毒需經10μg/ml胰酶處理和無血清培養基維持，認為這對感染是必需的。胰蛋白酶的活性受保存時間、不同的生產批號等因素的影響。因此，建議在接種 病毒之前，可以先測定維持液中胰蛋白酶的需要量。方法是在維持液中加入不同 濃度的胰蛋白酶（通常為05、10、15……10μg/ml），當旋轉培養中的MA104細胞 長成單層後，不要接種病毒，而是換上加有胰蛋白酶的維持液。一般在數小時之內， 高濃度的胰蛋白酶將引起細胞單層脫壁。24小時之後，最適濃度的胰蛋白酶至少應 有50%的細胞單層未脫壁。關於胰蛋白酶促進輪狀病毒感染性的機理，可能是由於對細胞的直接影響或破壞 了病毒增殖的抑製物。現大多趨向認為，輪狀病毒複製方式不同於其它呼腸孤病毒， 它不是通過吞飲作用進入細胞，而是通過胞漿膜直接進入胞漿，其穿入依賴於Vp4 。這一過程是通過胰酶作用於Ｖp4，特異性裂解成Vp５和Vp8（6 ０kDa，28kDa），從而使病毒變為有感染性。 類似於流感病毒和副流感病毒在蛋白酶作用後，囊膜的糖蛋白被消除而使其感染 力活化。輪狀病毒的轉錄同其它正呼腸孤病毒一樣。胰蛋白酶處理不能使人的 輪狀病毒在細胞培養中適應。除某些牛、豬輪狀病毒株外，其它動物的輪狀病毒在細胞培養物中增殖時，一般不 產生細胞病變，或隻產生輕微而不穩定的細胞病變。大多數初代 分離物需要在細胞培養物中連傳幾代才能見到細胞致病作用。細胞病變表現為 細胞腫大變圓、脫落、顆粒增多、細胞變暗，有時出現融合灶及拉網現象。但 有時僅表現粗糙感，細胞並不脫落。有的毒株不產生細胞病變，需要用熒光抗體 法等手段檢測。輪狀病毒也可產生蝕斑，Matsuno等（1977）報道，覆蓋瓊脂中 含有胰蛋白酶時，輪狀病毒可以形成蝕斑，最佳配方據報道為乙酰化胰酶 （3μg/ml）、DEAEDextran（50μg/ml）以及06%純化瓊脂。除A型輪狀病毒外，其它輪狀病毒的許多毒株迄今未能適應細胞培養，分離的成功率 約在40%～70%，因此有時隻能用經口感染易感動物來分離和複製病毒。自情侶鸚 鵡分離的一株輪狀 病毒，經卵黃囊接種可致死雞胚。至目前為止，沒有有關其它禽輪狀病毒在雞胚 中增殖的文獻報道。悉生仔豬、悉生羔羊可用來增殖豬、犬、猴、馬、牛或人的病毒。更 為理想的動物模型是小鼠，4～14日齡抗體陰性者感染率可高達95%，牛、猴或人的 毒株均可誘發腹瀉。
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