雞傳染性支氣管炎病毒（二）

雞傳染性支氣管炎病毒

7.培養傳染性支氣管炎病毒能在雞胚、器官培養的雞胚氣管以及來自雞和雞胚的多種細胞培養物 內生長。初代分離最好應用雞胚。(1)雞胚：一般采用9～11日齡雞胚的尿囊腔接種。最初幾代雞胚極少發生變化，隨著傳代次 數的增加，雞胚死亡率增高，雞胚病變明顯。至10代時，可使80%雞胚死亡。主要病變為 雞 胚停止生長，卷曲呈球形，即所謂卷曲胚。羊膜水腫增厚，緊貼雞胚，尿囊液增量，卵黃囊 皺縮，腎中尿酸鹽沉著，雞胚發生肝壞死、肺炎和腎炎。病毒也能在絨毛尿囊膜上增殖， 但不產生病斑。尿囊腔接種後36小時，病毒的最高滴度可達107個雞胚致死量。一般以絨毛 增殖曲線，常因培養溫度和毒株而異。將接種病毒後的雞胚置34℃孵育時，至少需延長30小 時，才能達到38℃孵育時的效價，而且僅有20%雞胚死亡。(2)器官培養：器官培養的氣管在分離傳染性支氣管炎病毒上的用途，尚未充分肯定，但 已有應用氣管培養研究這種病毒的報道，例如用其作為中和試驗的指示係統等等。傳染性支 氣管炎病毒感染的體外培養氣管，其纖毛細胞變圓脫落，纖毛運動停止。(3)細胞培養：雞傳染性支氣管炎病毒能在15～18日齡雞胚的腎細胞、肺細胞及肝細胞培 養物內生長。其中以腎細胞最敏感，其次是肺細胞、肝細胞和雞胚成纖維細胞。低代次的雞 胚分離株在細胞培養物上生長不良或不生長。6～10代的雞胚傳代毒株，在腎細胞培養物上 能產生常見的細胞病變，但某些毒株即使在細胞培養物上連傳10代，也隻產生輕度病變。主 要細胞病變為出現融合細胞和細胞壞死。一般於接毒後6小時，即可見到融合細胞， 18～24小時左右，可能出現幾十乃至100個以上核的巨大融合細胞，細胞最後死亡。在 堿性條件下，細胞病變出現較早，而且較廣泛。在肝細胞培養物中的融合細胞較小，肺細胞 培養物中的融合細胞不明顯。細胞培養物內的病毒濃度於24～36小時達最高峰。已經 適應雞胚的某些毒株還能在猴腎細胞培養物(如Vero細胞)上傳代，並產生融合細胞和蝕斑 ，但不能在其它哺乳動物細胞係統中傳代。雞傳染性支氣管炎病毒在易感宿主細胞的胞漿內複製。感染後6～15小時，發育的病毒粒子 開始由胞漿內呈新月形向空泡腔凸現。當病毒粒子成熟時，空泡膜結合入病毒的外套。尚未 見有從細胞膜表麵出芽的現象。雞傳染性支氣管炎病毒在雞胚腎細胞上形成蝕斑，蝕斑數目與接種劑量成線性關係。培養時 應保持8%CO2和85%的相對濕度。蝕斑抑製技術是測定雞血清抗體水平的1種準確方法。

8.病原性在自然條件下，雞傳染性支氣管炎病毒感染各種年齡的雞，主要侵害1～4周齡的雛雞和幼雞 。病毒經氣管內接種後，首先在呼吸道內增殖，經18～36小時的潛伏期後發病。主要症狀為 精神 不振，呼吸困難，氣管口[KG-*8]羅音， 咳嗽，噴嚏。病程6～18天。幼雞的病死率約25%，雛雞可達75 %～90%。6周以上的雞通常不死亡。產蛋雞的產蛋量下降，並常產出軟殼蛋和畸形蛋，蛋的 質量降低。某些毒株，如馬薩諸塞株可引起雞的腎病。給7日齡雛雞進行人工氣管內感染，約經2～3天的潛伏期，常出現甩鼻、抓鼻和口[KG-*8]羅音以及伸頸張嘴喘氣等呼吸道症狀。幼雞的病理變化是鼻竇炎、卡他性氣管炎、支氣管炎、肺充血和水腫，偶而氣囊混濁增厚。 鼻道中常有卡他性滲出物，支氣管內有幹酪樣堵塞物。由侵害腎髒的毒株致病時，腎髒腫 大，蒼白，腎小管和輸尿管內充滿尿酸鹽結晶。在實驗條件下，適應雞胚的別但泰株(Beaudette)和馬薩諸塞株在腦內接種乳鼠時，引起 神經麻痹並死亡。給2日齡兔作腦內接種，也可引起感染。雉也可感染，常與支原體或細菌等發生混合感染。火雞靜脈內接種，可保持48小時的病毒 血症。豚鼠對IBV感染有抵抗力。尚未發現感染組織的細胞內有病毒包涵體。

9.生態學雞傳染性支氣管炎病毒具有高度的感染力，在雞群中傳播迅速，幾天內即可波及全群。感 染後 從呼吸道分泌物排出病毒長達2周，糞便排毒3周以上(Moore等1977年報道，糞便排毒可達數 月)。病毒也可存在於感染雞的精液和急性期病雞所產的蛋內。康複雞可帶毒35天。曾有人 從實驗感染後49天的隔離幼雞中檢出病毒。疾病主要通過病雞咳出的飛沫經呼吸道 傳播，也可通過汙染的飼料、飲水和飼養用具引起間接傳播。某些學者認為經病雞蛋傳播是 暴發本病的重要原因。

10.免疫自然感染和人工感染都可獲得自動免疫。感染後第3周，產生大量中和抗體。康複雞可獲得 約1年的免疫力。自然感染或人工感染後恢複的母雞，其蛋內存在母源抗體，能給 新孵出的 雛雞提供天然獲得性免疫。這種雛雞的血清抗體可保持14天，以後逐漸降低、消失。被動免 疫隻能減輕疾病的症狀，不能預防本病毒的呼吸道感染。本病的免疫接種，經曆過不同的曆史階段。最初(1941)是用比較良性的野外毒株接種雞群 中的7～15周齡幼雞，使其自然傳播而獲得免疫，以減少經濟損失。此法接種反應較重，並 有長期散毒危險。以後改用滅活疫苗多次接種的方法，但免疫效果不理想。現在多用雞胚化 弱毒疫苗接種。弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株連續通過雞胚25代以上獲得的。一 般認為選用馬薩諸塞型作為疫苗株較好，因為馬薩諸塞型能對異型毒株也產生較好的免 疫力，其次是康涅狄格疫苗株。疫苗株的致弱程度，隨具體需要而定。肉用雞要求早期接種 ，不需長期免疫，因此疫苗株的病原性要很低，隻要能夠產生短期的免疫力就可達到目 的。產蛋雞和種雞宜選用免疫期較長的疫苗株。疫苗接種的年齡，肉用雞於生後1周第 1 次接種，至1月齡時再接種1次。種雞及產蛋雞應於2～4周齡接種疫苗。一般於接種後2～3 周產生較強的免疫力。疫苗接種方法有噴霧法、噴粉法和飲水法。最常用的是飲水法，其缺 點是疫苗受環境條件的影響較大，以致影響免疫效果。當前存在的主要問題是疫苗株還有一 定的致病性和傳播能力，接種疫苗後引起輕度的呼吸道反應。當雞群中存在致病性支原體 時 ，會成為慢性呼吸道病暴發的激發因素。另外，傳染性支氣管炎病毒的血清型之間 經常缺乏交叉保護，或者交叉保護性不強，因此，應用疫苗之前，應對疫苗株與當地流行毒 株之間的免疫學關係有所了解，國外已有雙價疫苗的生產。目前廣泛應用H120和H 52株弱毒疫苗，前者適用於1～3周齡雛雞的初次免疫；後者適用於5～15周齡的青 年雞的第2次免疫。均用滴鼻法或飲水法接種。兩次免疫接種後的免疫期約1年。關於雞傳染性支氣管炎疫苗株與雞新城疫疫苗株聯合製苗的問題，學者們存在不同意見。Ma rkham等認為雞傳染性支氣管炎疫苗和雞新城疫疫苗聯合應用，不致互相幹擾； 而Hanson等和Raggi則認為兩種疫苗聯合應用有幹擾作用，主張單獨 使用。

11.診斷根據雛雞或幼雞的急性、高度接觸性呼吸道感染和高病死率以及母雞產蛋量顯著降低和產畸 形蛋等病史，可作出推測性診斷。最後確診需進行病毒分離和血清學試驗。(1)病毒分離：①檢樣的采取和處理：肺、支氣管和氣管是病毒增殖的最初部位，是分離傳染性支氣管炎病 毒的適宜材料。但在感染後10～14天，就不易從這些部位分離獲得病毒(少數帶毒雞可能帶 毒1 個月以上)。在感染初期分離病毒，應取氣管拭子，浸泡於每毫升含有1 000U青黴素和1 00 0U鏈黴素的2ml肉湯內。在有腎病變的病例，如果懷疑有傳染性支氣管炎病毒存在，分 離病毒時還應包括腎髒，但其含毒量較低。實驗性感染雞傳染性支氣管炎病毒的病雞，可在 感染後12～ 49天內發現病毒。分離時間愈早，分離成功率愈高。組織應無菌采取，用乳缽、玻璃組織研 磨器或超聲波處理後，稀釋和懸浮於胰蛋白磷酸鹽肉湯或pH72的緩衝鹽水中，每毫升含1  000U青黴素和1 000mg/mL鏈黴素，並置室溫感作30分鍾。也可用慶大黴素硫酸鹽，用量為 每毫升100～200μg。由於病毒血症的時間很短，血液不是分離病毒的理想材料。②病毒分離培養：病料要盡快進行病毒分離，否則應低溫冰凍保存。初代分離培養最好用雞 胚。將如上製備的材料接種於9～11日齡雞胚尿囊腔內。雞胚可能於接種後的7天內死亡， 或發育停滯，羊膜增厚或纖維變性，或在中腎出現尿酸鹽沉著。因為新分離的雞傳染性支氣 管炎病毒在最初幾代雞胚中常不引起發育停滯和死亡，可能看不到病變。所以最好在接種後 48～72小時收獲1～2個雞胚的尿囊液並接種另1組新的雞胚。剩下的雞胚則繼續孵育7天， 檢查傳染性支氣管炎的典型病變。這樣的盲目傳代，至少進行3代。已經適應雞胚 的病毒在接種雞胚腎細胞培養物時，常能良好生長。主要的細胞病變是出現合胞體。合胞體 的體積和數目隨孵育時間的延長而增加，最後發生壞死。③病毒鑒定：取初代雞胚尿囊液，經氣管接種於易感雛雞，如為本病，則在接種後18～36小 時出現氣管口[KG-*8]羅音，用同型特異 抗血清可抑製這種致病作用，從而作出鑒定。另外，據 Raggi等(1975，1976)報道，給雞胚預先接種傳染性支氣管炎病毒，隨後再接種雞新城 疫病毒B1株，可以幹擾B1株產生血凝素。而且傳染性支氣管炎病毒的這種幹擾作用， 能被同型特異抗血清所抑製，故可作為傳染性支氣管炎的1種診斷方法。根據同樣原理， 也可在雞胚腎細胞培養物上進行這種幹擾試驗，以檢測試驗血清中是否存在傳染性支氣管炎 病毒的抗體，即在細胞單層上加入連續2倍稀釋的試驗血清和等量傳染性支氣管炎病毒感染 雞胚尿囊液的混合液，37℃孵育30小時之後，再用106EID50雞新城疫病毒接種培養 物，繼續放37℃孵育，檢查雞新城疫病毒的致細胞病變作用。鑒定本病毒的最常用方法是病毒中和試驗，即用已知的抗傳染性支氣管炎血清與新分離毒株 在9～11日齡雞胚上進行中和試驗，出現中和反應即可證實其同一性，不出現中和反應，就 說明是不同血清型的傳染性支氣管炎病毒或者不是傳染性支氣管炎病毒。雞傳染性支氣管炎 病毒的中和試驗有固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法兩種，請參閱本書第十四 章有關內容。

(2)血清學試驗：①病毒中和試驗：應用已知的病毒檢查待檢血清中的特異性抗體。分別采取病初和2～3周 後的雙份血清，同時測定兩份血樣對雞傳染性支氣管炎病毒的中和抗體效價，如第二次(康 複期)血樣的中和抗體滴度高於第1次血樣4倍以上，即可診斷為雞傳染性支氣管炎。②熒光抗體試驗：可用於雞傳染性支氣管炎病毒感染的快速診斷——檢測急性病雞氣管塗片 中的雞傳染性支氣管炎病毒。取氣管上皮塗片，在空氣中幹燥，丙酮固定後，用熒光抗體 在37℃濕盤中染色15～30分鍾。將染片在pH72緩衝鹽水中涮洗，而後幹燥，滴加緩衝鹽水 和甘油的等量混合液，蓋上蓋玻片，即可在熒光顯微鏡下檢查。因在各個血清型之間具有某 些交叉反應性，所以熒光抗體不能鑒別到型。③瓊脂擴散試驗：用感染的雞胚絨毛尿囊膜懸液製備的抗原，放置在瓊脂板的中央孔內， 將待檢血清加在鄰近的孔中，然後觀察這兩孔之間的沉澱線。病後至少7天血清中才出 現沉澱抗體，持續20～94天。比較疾病早期和晚期兩種血清樣品中沉澱抗體的量，如晚期有 明顯增多，即可作出診斷。④間接血凝試驗：應用間接血凝試驗診斷雞傳染性支氣管炎，方法如下： 以醛化鞣化的兔紅細胞作載體，用IBV進行致敏，然後用明膠作穩定劑去掉其與非特異 性蛋白相結合的性能，研製出IB間接血凝試驗抗原。用該抗原直接與待檢血清作間接 血凝試驗即可作出診斷。結果表明，本法對IB具有較高的敏感性和特異性，而且操作簡便。 經與新城疫、馬立克氏病及傳染性喉氣管炎等多種雞病進行鑒別試驗，表明有明顯的特異性 。⑤其它：其它血清學試驗如直接和間接補體結合試驗以及血凝試驗和血凝抑製試驗也曾用於 雞傳染性支氣管炎抗體的檢測，但均未廣泛應用。Muneer等(1988)報道用免疫酶斑點試驗 檢測抗IBV抗體，證明是1種經濟、簡便和靈敏的方法，可望成為本病早期診斷、疫病普查 和疫苗免疫測定的有用方法。