豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine)豬傳染性胃腸炎(TGE)是豬的1種具有高度接觸傳染性的病毒性疾病。臨床特征為嚴重腹瀉 、嘔吐和脫水，不同年齡和品種的豬都易感，但2周以內仔豬的病死率很高，5周以上的豬很 少死亡。其它動物包括實驗動物均無感染性。1933年起，美國的依利諾斯州就有本病記載，此後在美國廣泛流行。1946年，Doyle 等確定本病的病原體為病毒，並作了比較詳細的報道。1956年在日本，1957年 在英國相繼發生本病。以後法國、荷蘭、德國、匈牙利、意大利、波蘭、前蘇聯、羅馬尼 亞、比利時、南斯拉夫、我國台灣省、馬來西亞和加拿大相繼報道了本病。現在除阿拉斯加 、北歐各國之外，在北半球，特別是北緯三十度以北的溫帶至寒帶地區，均有本病分布。從 六十年代末期起，我國就有關於本病的報道。引起豬傳染性胃腸炎的病毒為冠狀病毒。其它病毒如輪狀病毒、腺病毒、呼腸孤病毒以及腸 道病毒等亦可引起豬的傳染性腹瀉。本節隻介紹豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)。
1.形態特征經濾過試驗、超速離心和電鏡觀察，證明病毒粒子的直徑為90～200nm，呈圓形，有的呈橢圓形或多邊形。有雙層膜，囊膜上覆有花瓣狀纖突，纖突長18～24nm，以 極小的柄連接在囊膜的表麵，其末端呈球狀，直徑約10nm，製片時容易使纖突脫落，所 以經常隻看到囊膜的邊界，或者隻在囊膜的某些部位有這種花瓣狀纖突。某些病毒粒子在以 磷鎢酸負染後，可見到1個電子透明中心或沒有特征的核心，其形態與粘病毒的管狀或螺 旋狀的核蛋白結構不同。最近，有人描述豬傳染性胃腸炎病毒粒子內部具有1個呈串珠 樣的絲狀物。電子顯微鏡觀察，豬傳染性胃腸炎病毒的形態類似雞傳染性支氣管炎病毒和其 它冠狀病毒。關於病毒粒子的大小，各書記載稍有差別。曾有報道，豬腎細胞培養物中的病 毒粒子，平均直徑為95nm。另一些報道證明，豬小腸上皮細胞內的病毒粒子的直徑為65 ～95nm。病毒粒子在直徑上的差別，可能與細胞類型及標本製作方法不同有關， 並非毒株之間的規律性差別。
2.基因組結構特點TGEV基因組結構尚未完全闡明,通過對Purdue115細 胞適應株基因組RNA的3'端83kb序列的測定，證明它包括亞基因組RNA表達的全部基因組。 除mRNA E外，其餘TGEV亞基因組RNA在功能上似乎都是單順反子。5'端約20kb被認為是轉錄R NA聚合酶的，在TGEV感染的細胞中早已發現有RNA聚合酶活性，但該蛋白質至今尚未分離 鑒定。
3.理化學特性本病毒含單鏈RNA。鹵化脫氧尿核苷不能抑製病毒增殖。以核糖核酸酶處理，能破 壞病毒的感染性，但病毒能抵抗脫氧核糖核酸酶的作用。已經分離獲得感染性RNA。病毒的囊膜纖突由分子量為200kDa的多肽和糖類組成，在用菠蘿蛋白酶處理後消失 。病毒對乙醚、氯仿和去氧膽酸鈉敏感。在20%乙醚中於4℃放置1晝夜，在氯仿中於室溫放置 10分鍾，病毒即完全失去感染力；用01%去氧膽酸鈉處理1小時，部分失去活力。01%十二烷基硫酸鈉處理1小時，完全失去活力。病毒在膽汁中相當穩定。對胰酶有抵抗力。但是強毒株和弱毒株對胰酶和蛋白分解酶的感受性不同：毒株的毒力越弱，對胰酶的感受性 越高。例如強毒SH17株，於37℃05%胰酶處理2小時，不降低感染力；而致弱的To163株經37℃30分鍾，毒力降低99%以上。病毒在pH4～8時穩定。在低溫條件下，pH3時仍穩定。 大多數毒株在pH2時1小時滅活。但強毒株和弱毒株對pH的敏感性也不一致。在pH 3時，37℃下可使病毒很快滅活，而在22℃則滅活緩慢。弱毒To163株在22℃2小時完全滅 活 ，強毒SH17株在22℃8小時仍可測出活存病毒。病毒在一定pH下，溫度越高，滅活越快。 細胞培養物中的病毒在50℃經30分鍾，其感染力的降低程度，各學者的報道不盡一致：有降 低2～3個對數，也有隻降低1個對數者。豬小腸組織內的病毒，56℃加熱30分鍾後，部分滅 活。56℃經45分鍾或65℃10分鍾全部滅活。將病毒懸浮於1mol/L氯化鎂溶液時，能加強溫 度的滅活作用。豬傳染性胃腸炎病毒對光敏感，將105個半數豬感染劑量的糞便材料置於平皿內，在日光 下照射6小時，可使病毒滅活。紫外線能使病毒迅速滅活。05%石炭酸在37℃處理30分鍾， 可殺死所有病毒。005%甲醛溶液37℃20分鍾也能使病毒滅活。病毒在凍結保存時極為穩定 。在-18℃保存18個月，病毒滴度由106降到105。細胞培養病毒在-20℃、-40℃、-80℃ 保存365天，滴度沒有明顯降低。但在37℃放置4天，則完全失去感染力。本病毒SH株和TO株在4℃條件下能凝集雞、鼠和牛的紅細胞，但不凝集小鼠和鵝的紅細胞。
4.幹擾現象某些非細胞致病性TGEV毒株能幹擾偽狂犬病病毒在細胞培養物中的複製。也能幹 擾細胞致病性牛腹瀉粘膜病病毒的複製，因此常用這種幹擾作用，將牛腹瀉粘膜病病毒 作 為豬腎細胞培養物內是否存在TGEV的指示係統。方法是將被檢材料接種豬腎細胞培養物，3 7℃培養4天後，吸除被感染的培養液，用PBS衝洗細胞2次，再接種牛腹瀉粘膜病病毒， 並加入新營養液，繼續培養。如不出現細胞病變，即證明豬腎細胞培養物內有TGEV存在。
5.抗原性對來自美國、英國和日本的10個毒株(包括用豬傳代和用細胞培養物傳代的毒株) 進行交叉中和試驗和蝕斑減數試驗，證明TGEV隻有1個血清型，各毒株之間有密切 的抗原關係。而且TGEV與貓傳染性腹膜炎病毒和犬冠狀病毒之間存在抗原相關性 。通過免疫擴散試驗，表明在TGEV和血凝性腦脊髓炎病毒(HEV)之間有交叉反應，但蝕斑中 和試驗看不到交叉反應現象。近年來，國內將我國分離的經豬傳代的“TGE”華毒株、“TGE”吉毒株等與TGE的Miller (M )毒株進行了交叉熒光抗體試驗，證明華株與吉株相一致，但與M株不出現交叉反應。1979年 黃均健等應用熒光抗體、中和試驗、酶聯免疫與豬體交叉保護試驗等，發現華株與M株、S H株和TO株不同。1981年錢永清等應用比利時的CLV(Coronalike virus)血清、華株血清 和M株血清製成的酶標記抗體進行交叉染色，證明由華株血清與比利時CLV血清所製備的酶標 記 抗體可著染華株，但不著染M株和SH株；而由M株血清所製備的酶標記抗體能著染M株和SH 株，但不著染華株，從而證實華株與比利時的CLV在血清型上是一致的。1984年宣華等應用 豬胎腸 組織上皮細胞單層培養分離吉毒株等獲得成功，並與華株、川株、M株進行了交叉中和試驗( 細胞培養法)，證明吉株與華株、川株一致，而與M株不呈現交叉中和反應，從而證明我國除 豬傳染性胃腸炎病毒之外，還存在豬流行性腹瀉病毒。
6.培養1956年Lee首次報道TGEV可在豬腎細胞上連續傳28代，但無細胞病變。日本原田(1 963)首次報告：TGE病毒SH株能在豬腎細 胞上產生細胞病變，其後多次報道了 應用原代豬腎細胞培養物分離獲得細胞致病性TGEV毒株。也有用豬睾丸細胞、豬甲狀腺 細胞、唾液腺細胞、犬腎細胞、豬食管、回腸、盲腸、結膜、鼻粘膜上皮等進行TGEV分 離傳代的報道。初次傳代時，野毒株產生的細胞病變可能是短暫的或輕微的，有時僅在整個培養物中出現 幾個小點，易被忽略。在用豬腎細胞盲傳若幹代之後，才能看到比較明顯的細胞病變，如 細胞腫脹，胞漿內形成空泡，細胞變圓，皺縮，有顆粒，有的破碎崩解，部分細胞從單層上 脫落，形成網眼狀。但是即使延長培養時間，也不會使整個細胞單層破壞。而且某些毒株， 即使盲傳多代，也不產生細胞病變。豬的甲狀腺細胞、唾液腺細胞和豬睾丸細胞對TGEV較敏感。Witte(1971)報道， 在26份檢樣中，22份在豬甲狀腺細胞培養物中出現不同程度的細胞病變，細胞單層約25%破 壞，並在第1代培養物中即可出現細胞病變。Stepanek(1971)認為TGEV的細胞病變在 原代豬唾液腺細胞上的發展比原代豬腎細胞快。TGEV在細胞漿中增殖，不能在核內增殖，不產生包涵體。低代次的細胞培養傳代病毒對無特定病原豬(SPF豬)有高度致死率，產生典型症狀。高代次( 125代)細胞培養傳代病毒的致病性顯著降低。TGEV不易在雞胚和各種實驗動物體內生長。最近曾有犬能被實驗感染的報道，但有待進一 步證實。
7.病原性TGEV除使豬發病外，其它動物如小鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狐狸、犬和燕八哥等雖 口服大量病毒也不發病，但能從口服病毒後的貓、犬(7～14天)、狐狸(15天)和燕八哥(32 小 時)的糞便中回收到病毒。1977年原東德報告了3群獵犬自然暴發本病，病犬呈現腹瀉、嘔 吐、衰竭等症狀，用其糞便喂健康仔豬引起了本病。TGEV能使各種年齡的豬發病，5日齡以下仔豬的病死率最高，可達100%。隨著年齡的增 長，病死率逐漸降低。16日齡以上仔豬的病死率降至0%～10%。TGEV的靶器官是小腸。病毒雖可存在於病豬的各器官、體液和排泄物中，但以病豬的空 腸、十二指腸、腸係膜淋巴結的含毒量最高，滴度可達每克組織含106個豬感染劑量。 呼吸道感染後，病毒先在鼻粘膜和肺中增殖，而後經血液進入小腸。病毒也可直接經口、咽 、食管、胃(豬傳染性胃腸炎病毒有抵抗胃酸和胰酶的作用)進入小腸。小腸的上皮細胞發 生感染，空腸和回腸的絨毛顯著萎縮，影響消化和吸收。由於腸粘膜功能性上皮細胞的迅速 破壞 脫落，降低了產生某些酶的能力，病豬不能水解乳糖及其它營養成分，乳糖蓄積腸腔，引起 滲透壓增高，水分滯留，甚至吸收組織中的液體，從而導致病豬發生嚴重腹瀉和脫水。本病的潛伏期很短，一般為24～36小時，有時12～18小時。發病仔豬，往往首先嘔吐，繼而 發生嚴重的水樣腹瀉，以致脫水死亡。3周齡以上的豬發病後通常可以恢複。豬傳染性胃腸炎最常發生於冬季和早春的寒冷月份。經常可使整個豬群的易感仔豬全部或多 數發病。主要的病理變化為急性腸炎，伴有充血和壞死，腸管擴張，充滿液體，小腸壁變 薄，空 腸和回腸纖毛顯著萎縮，腸係膜淋巴管內沒有乳糜。心、腎可出現退行性變化。
8.生態學十二指腸、空腸、回腸粘膜中的病毒檢出率和病毒滴度最高，特別是空腸。病毒在鼻腔、氣 管、肺等呼吸道粘膜及扁桃體、頜下淋巴結、腸係膜淋巴結等淋巴係統也能良好增殖。TGEV隨病豬和恢複期帶毒豬的糞便和鼻汁排出。經糞便排毒的持續時間約8周。Underdahl (1975)經鼻腔內接種SPF豬，30～104天後，仍可從肺和小腸分離到病 毒，且可在56%的豬體內看到肺部肉眼病變。Kemeny 等(1975)檢查了與感染仔豬同居的 繁殖母豬的鼻汁、乳汁和糞便，發現鼻汁中的病毒檢出率最高。上述事實表明，TGEV經消化 道和呼吸道均可感染。康複豬帶毒的時間相當長，病豬和康複豬都是主要的傳染來源。犬、 狐狸和燕八哥能短期帶毒，在傳播本病方麵可能起一定的作用。
9.免疫有關豬傳染性胃腸炎的免疫問題，各國已經做了許多研究工作，大多數是以對哺 乳仔豬提供乳汁免疫為前提的。使用過的病毒製品有強毒、滅活疫苗和弱毒疫苗。接種妊娠 母豬的途徑有經口、鼻、肌肉和乳腺內接種等方法。總的說來，妊娠母豬於臨產前20～40天 ，經口內服強毒能夠產生良好的乳汁免疫，但有散播強毒，使本病常在化的危險。應用免疫 血清作非經口接種，沒有被動保護作用，說明乳汁抗體可能存在於腸腔內而對仔豬呈現免疫 保護作用。近幾年來，通過細胞培養傳代和蝕斑挑選，培育和 試驗了幾個弱毒株，正在進行實驗室和野外試驗。初步證明能給哺乳仔豬提供一定的乳汁免 疫，但不理想。關於接種妊娠豬的最有效途徑，目前還存在不同意見。一般認為給母豬作口 、鼻同時接種或乳腺內接種，能給哺乳仔豬提供較好的乳汁免疫。乳汁抗體包括IgG、IgA和 IgM，IgA抗體主要是分泌型IgA，僅由腸管受抗原刺激時產生，泌乳期間滴度較高，持續時 間較長，是乳汁免疫的主體。IgG抗體因非經口接種而產生，在乳汁中迅速下降或消失，因 此在乳汁免疫中的作用不大，隻能起一定的協同作用。至於IgA的形成機理，一般認為是由 於病毒抗原刺激腸管的淋巴小結，致敏淋巴細胞分裂增殖，產生淋巴母細胞，經淋巴流、血 流聚集於乳腺，於局部產生IgA抗體。乳汁免疫可以減少TGEV感染仔豬的死亡率 ，但是仔豬一停止吃母乳，又可感染發病，因 此 不能解決豬群的免疫問題。近些年來，各國對本病的自動免疫進行了研究，以期獲得安全 有效、並迅速產生免疫力的弱毒疫苗。日本培育的弱毒To163株對哺乳仔豬無病原性，給 新生仔豬經口接種To163株107TCID50/5ml，能使其產生一定程度的自動免疫性。 但 是免疫效果受環境溫度和初乳的影響較大。根據實驗結果，在18～22℃飼養的豬，弱毒接種 3～4天後，即產生免疫，而在31～34℃飼養的豬卻完全不產生免疫力。野外應用時，也 受地區溫度的影響，越是氣溫低的地區，產生的抗體效價越高。此外，於21～22℃飼養的豬 ，接種弱毒後，消化道內病毒的增殖，受攝食的初乳的抑製；而35～36℃和10～11℃飼養的 豬幾乎不受攝食初乳的影響。產生上述現象的機理，尚待進一步研究。據報道，最近哈爾濱 獸醫研究所研製成了豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的二聯細胞培養滅活苗，免疫效果較好 。感染TGEV的豬明顯改變其對某些疾病的抵抗力或免疫機能。Regulard(1965年)報道，在 出現TGE症狀之前以及出現TGE症狀後，給其注射豬瘟弱毒疫苗，常不能 產生對豬瘟的有效免疫力。
10.診斷當不同年齡的豬於寒冷季節發生水樣腹瀉、嘔吐，兩周內仔豬病死率很高，疾病傳播迅速和 發病率很高等現象，都是初步診斷的依據。但如上述，豬的輪狀病毒和豬流行性腹瀉病毒等 也 能引起類似的疾病，在流行病學和症狀上很難區別，因此必須依靠病毒分離和血清學試驗， 才能最後確診。
(1)病毒分離：①乳豬接種試驗：采取急性發病並具有典型症狀的病豬空腸(包括腸內容物)及腸係膜淋巴結 ，用緩衝鹽水(或Hanks液)製成1∶5～1∶10懸液，2 000r/min離心沉澱20分鍾，取上清液加 入青黴素和鏈黴素，使其最終濃度各為1 000U或mg/ml，在4℃感作2～4小時，或用過濾法除 菌。 隨 後經口投給2～3日齡健康乳豬2～4隻。如果經12～48小時出現典型症狀，即可結合流行 病學予以診斷，但仍不能排除其它病毒的可能。②應用細胞培養分離鑒定病毒：采取接種試驗典型發病豬或自然發病豬的空腸及腸係膜淋 巴結，用緩衝鹽水或含05%乳白蛋白水解物的Hanks液製成1∶5～1∶10懸液，加入青黴素 和鏈黴素各1 000U或mg/ml，超聲波處理後2 000r/min離心沉澱20分鍾。吸取上清液 用G6號玻璃濾器或濾膜(孔徑02μm)過濾，濾液即為接種材料。 以繼代豬甲狀腺細胞和唾液腺細胞較敏感，初代培養即可見到輕微的細胞病變。原代豬腎 細胞和豬睾丸細胞需盲傳多代才可見到細胞病變。傳代細胞對新分離的病毒株不敏感。原代豬胎腎細胞的培養按常規方法進行。成年豬甲狀腺細胞培養比較困難，應選用小豬的新 鮮甲狀腺。采取後立即放入含青黴素和鏈黴素各1 000U或mg/ml的Hanks液中，浸 泡1小時，而後浸入95%酒精，迅速取出，輕微火燒1～2次以達徹底殺死表麵細菌的目的。除 去甲狀腺包膜和表層組織。剪取內部的甲狀腺組織，充分剪碎(約1mm3)，用無鈣、 鎂磷酸鹽緩衝液或Hanks液洗3～4次，至洗液清亮無油珠為止。加入025%胰蛋白酶，在37 ℃ 預消化半小時，再換胰蛋白酶消化15小時。吸除胰蛋白酶後，用Hanks液洗2次，加入營養 液反複吹打，靜置數分鍾，收集細胞小團塊進行培養，在37℃培養2～4天換液。第1次營養 液為含20～30%犢牛血清的05%乳白蛋白Hanks液。第二次營養液(換液)為含10%犢牛血清的 EMEM(或1640，199)和05%乳白蛋白Hanks液的等量混合液，維持液含2%犢牛血清。 接種病料前，先用Hanks液將單層細胞衝洗2次，按營養液1/10～1/3量加入接種材料，在37 ℃吸附1～2小時傾棄或吸除多餘的接種液，再加pH68～70的維持液，而後逐日觀察。一 般培養 3～8天(培養8天時需換液1次)收毒。如無細胞病變或細胞病變不明顯，應在細胞上連續傳 代培養3～7次。經多次傳代，仍無細胞病變時，為了證明細胞內是否有TGEV增殖，可用TGEV熒光抗體染色 法檢查細胞培養物。或用已知有細胞致病作用的牛腹瀉粘膜病病毒進行幹擾試驗。也可應 用電鏡進行直接觀察。如已出現細胞病變，即可在細胞培養物上測定毒力，並作病毒鑒定。將細胞培養病毒作連續 10 倍稀釋，每1稀釋度接種4個細胞培養管(瓶)。37℃感作1小時後，加入維持液，並置37℃繼 續培養，按Reed和Muench法或其它法計算TCID50。隨後進行中和試驗，將標準血 清56℃加熱30分鍾，再將血清連續2倍或4倍稀釋，加入等量的病毒懸液(約含200TCID50 /01ml)。將混合液置37℃感作1小時，而後取每1混合液01ml分別接種試管內的細 胞培養物。每1血清稀釋度最少應用兩管。以中和50%病毒的血清最高稀釋度的試管為終點 ，其倒數即中和效價。
(2)血清學試驗：血清學試驗包括中和試驗、熒光抗體試驗、間接血凝試驗、皂土凝集試驗、環狀沉澱 試驗和瓊脂擴散試驗等。其中應用最多、檢出率和特異性較好的是中和試驗，其次是熒光抗 體試驗。日本清水等(1976)用精製病毒對野外病例的血清進行間接血凝反應，認為間接 血 凝價與中和抗體價有較高的符合率，可作為快速診斷方法。其餘各種方法與中和試驗的符合 率較低。中和試驗法是采取發病時和恢複後的血清，測定中和抗體價是否升高。如果恢複後血清抗體 價升高，即為陽性。一般在感染後7～8天，最早在第4天，血清中就出現中和抗體，至少可 持續18個月。中和試驗的具體進行方法又分仔豬接種法和細胞培養法。自從TGEV的細胞致病株培養成 功之後，現在多采用細胞培養法，包括細胞病變抑製試驗、微量染色試驗、染色單層試驗和 蝕斑減數試驗。一般應用固定病毒稀釋血清法。無論應用何種方法測定都需數日才能完成 。其中以蝕斑減數法較為敏感。熒光抗體試驗也是實驗室內常用的1種方法。將感染豬的空腸製成冰凍切片，或刮取空腸絨 毛上皮細胞製成抹片，以丙酮低溫固定30分鍾，而後滴加TGEV熒光抗體，在37℃染色30分鍾 ，再用磷酸鹽緩衝液漂洗15分鍾，空氣幹燥，滴加甘油緩衝鹽水，以蓋玻片封固，即可在熒 光顯微鏡下檢查。也可應用間接熒光抗體技術。TGEV熒光隻見於感染細胞的胞漿內。據Pens aelt(1970)報道，熒光抗原在下痢初期較明顯，至絨毛再生時檢出率降低，於感染後7 天就不能檢出熒光細胞。 (3)電子顯微鏡和免疫電鏡觀察：①電子顯微鏡觀察：取TGE病豬糞便10ml，以001mol/L pH76 PBS作1∶4稀釋，高速離心 後，取上清1滴置於銅網上，用2%磷鎢酸負染後，在電鏡下觀察病毒粒子。②免疫電鏡觀察：取待檢的病毒濾液(抗原)2ml，加入1∶50稀釋的TGEV免疫血清8ml，於 37℃水浴中感作1小時後，放4℃冰箱過夜。次日，以7 000g離心30分鍾。沉澱物中加適量蒸 餾水重新懸浮，吸取上清1滴置於銅網上，以2%磷鎢酸負染後，於電鏡下觀察病毒粒子的凝 集狀況。應當特別注意，在歐州的許多國家以及美國發現1種豬呼吸道型冠狀病毒(Porcine respira tory coronavirus,PRCV)，該病毒主要在呼吸道生長，經呼吸道傳播。被感染豬症狀輕微或 無臨床症狀，但用荷蘭分離株經鼻接種SPF豬可引起致死性肺炎。PRCV與TGEV具有很高的抗 原相關性，除抗TGEV S蛋白單抗外，抗TGEV抗體以及大部分單克隆抗體均可與PRCV產生交叉 中和反應，在做病原和血清學試驗時，可依此進行鑒別診斷。
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