馬動脈炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)馬傳染性動脈炎(EA)的臨床特征是病馬發熱,步態僵直,軀幹及眼周圍水腫,出現粘液膿性鼻炎,外生殖道水腫,妊馬流產。本病在廄舍內迅速傳播,公馬也可接觸感染。1957年,美國Doll等人從俄亥俄州發生的以母馬流產為特征的病馬中分離出病毒,稱為馬動脈炎病毒,簡稱EAV。後來證明這種病毒引起的疾病,也就是在曆史上德國稱為,“Rotlaufseuche”、英國稱為“流行性蜂窩織炎紅眼綜合症”或“傷寒熱”的疾病。Doll分離的“Bucyrus”株病毒被認為是EAV的原型病毒。此後,美國的McCollum用馬腎細胞在肯塔基地區分離出病毒。經鑒定,證明該病毒與Bucyrus原型病毒株一致。歐洲首次在瑞士,後來在維也納也都分離獲得病毒。印度在1965年報道了EAV的血清學證據。過去,EA在臨床上常常與馬流感和馬鼻肺炎(病毒性流產)混淆。馬是這種病唯一的易感動物,自然感染主要發生在種馬場內。
1.形態和理化學特性EAV粒子呈球形,直徑60nm,沉降係數為224S±8S,在蔗糖和CsCl密度梯度中的浮密度分別為113~117g/cm3和117~120g/cm3。核衣殼直徑約35nm,沉降係數為158S,外披一層12~15nm厚的囊膜,囊膜表麵有12~15nm長的環狀纖突。病毒基因組為單拷貝線狀正鏈RNA,長約13kb,分子量41~43×106kDa,沉降係數為48S,3端有Poly(A)尾。基因組RNA具有感染性。病毒粒子含4種結構蛋白:核心蛋白N,分子量約14kDa;非糖基化的膜蛋白M,分子量約16kDa;小糖蛋白Gs,分子量約25kDa,以二硫鍵連接的同二聚體形式存在於病毒粒子上;大糖蛋白GL,分子量30~42kDa。在病毒粒子上GL不以單體形式存在,而是與M形成異二聚體。Gs是病毒的次要蛋白,僅占1~2%,但在感染細胞中含量很高,N、M和GL在病毒粒子上含量基本相當,分子比依次為3∶2∶3。
2.分子生物學EAV基因組全序列已被測定,有7個開放閱讀框架(ORF1~7)。亞基因組的引導序列長207nt,來源於基因組5端非編碼區。目前尚不清楚5端是否有帽結構。ORF1又分為ORF1a和ORF1b,占整個基因組5端的3/4,ORF1a和ORF1b有19nt長的重疊區。ORF1a編碼複製酶多聚蛋白,分子量約187kDa,該多聚蛋白被自身具有的蛋白酶活性區進一步裂解成6種非結構蛋白,命名為nsp1至nsp6,分子量分別為29,61,22,31,4和3kDa。nsp1中有2個木瓜酶樣的半胱氨酸蛋白酶活性區(PCP),稱PCPα和PCPβ。PCPα無活性,不能將nsp1切成nsp1α和nsp1β,隻有PCPβ有蛋白酶活性,專門切開nsp1/2間的酶切點,從多聚蛋白上釋放出來nsp1。而LDV和PRRSV的PCPα和β均有酶切活性,所以這兩種病毒均可產生nsp1α和1β。其它nsp是由nsp4中的絲氨酸蛋白酶活性區和另一種未知的蛋白酶加工產生的。比較不同EAV毒株序列,發現M和N氨基酸序列是保守的,GLN端親水區後1/2段氨基酸序列為非保守區,前1/2段氨基酸序列以及轉膜區和C端氨基酸序列為保守區。GL由ORF5編碼,其多肽鏈上有1~2個糖基化位點,由於糖基化程度不同所以有較大的分子量範圍。它是EAV最主要的保護性抗原,其55~98位氨基酸區域具有較強的免疫原性,它含有一個中和抗原表位,此抗原表位可能最充分地暴露於病毒粒子表麵,對刺激機體的免疫反應具有重要作用。單抗研究的結果表明,GL上有多個抗原表位,其某些氨基酸的改變可導致病毒中和特性的改變,從而產生中和性單抗逃脫變異株,如99~104之間氨基酸序列的突變以及96和113位氨基酸的改變都可導致這種變異株產生,這些區域均位於GLN端的非保守區內。感染細胞中GL未糖基化前為一20kDa的蛋白質,在內質網糖基化後,分子量變為30~42kDa。細胞中所有GL分子都通過二硫鍵與M連接形成異二聚體,而不以單體形式存在,M除與GL形成異二聚體外,自身還形成同二聚體,但成熟病毒粒子上並沒有M同二聚體,此外細胞中還有一部分為單體形式的M蛋白。Gs作為病毒粒子上的少數成份,卻在細胞中有大量表達,含量與M蛋白相當,它有一個N糖基化位點。感染細胞中的Gs有4種單體構型和1種二硫鍵連接的同二聚體結構,Gs單體選擇性地蓄留於內質網,它們對內切糖苷酶敏感。而Gs同二聚體對該酶有抵抗力,在病毒成熟過程中,通過高爾基體時被唾液酸化,此後包裝入病毒粒子。
3.遺傳變異與抗原性EAV迄今隻有一個血清型。不同地理來源的毒株在血清學上與1953年分離獲得的Bucyrus原型毒株基本一致。但近年研究發現EAV存在不同的抗原變異株。EAV的抗原性和免疫原性主要是由病毒粒子表麵的大糖蛋白GL決定的,它有最主要的中和抗原決定簇,有許多抗原表位。GL分子上某些氨基酸發生突變可導致抗原變異,產生免疫逃脫變異毒株。通過寡核苷酸指紋圖比較,發現不同地理來源的毒株之間在寡核苷酸同源性上有明顯差別,有的毒株間寡核苷酸同源性不到60%。Chirnside等(1994)比較了不同毒株M和N蛋白的基因序列及衍生的氨基酸序列,通過係統樹分析發現,EAV可能存在3個變異群(variant):以Bucyrus株為代表的美國變異群;以維也納株為代表的奧地利變異群和以Bibuna株為代表的瑞士變異群。
4.培養與增殖病毒可在多種培養細胞中生長並產生細胞病變(CPE)。常用的傳代細胞有馬腎細胞、兔腎細胞、猴腎細胞LLCMK2、馬皮膚細胞E.dermNBL6以及BHK21和Vero細胞。在BHK21及Vero細胞中可以產生蝕斑。可以利用蝕斑減數試驗鑒定病毒及抗體。早期試驗用LLCMK2猴腎細胞傳代時,雖然也可見到相應的CPE,但CPE出現較遲,至接種後100小時才能在細胞漿中出現特殊的膜樣結構,說明細胞已經發生變化,但卻看不到病毒粒子。而E.dermNBL6則非常適合於EAV的增殖,病毒複製快,產量也高。Bucyrus原型毒株在連續通過馬腎細胞傳代而減弱其對馬的致病力後,可用於免疫接種。EAV雖然可在上述各種細胞中增殖,但直接用病馬組織分離病毒時,僅馬源細胞產生CPE,在已適應馬源細胞以後,即可繼續在其它動物源的細胞中複製。電鏡檢查證明,病毒的形態發生與病毒的生長密切相關。細胞在感染後9~12小時,出現核蛋白體聚積以及許多異常現象,例如細胞漿內出現特殊的膜樣結構,但不能看到病毒粒子。到18小時,即可初次看到病毒粒子。在感染後的24、30、34直到43小時,隨著病毒滴度的增高,成熟病毒粒子的數目也增加。並可看到這些病毒粒子是從胞漿的空泡中芽生出來,聚積在空泡內和散在於細胞間的空隙中。細胞漿此時已完全損壞,細胞核內沒有病毒複製的跡象。胞漿空泡內病毒粒子的平均直徑是43±2nm。將病毒粒子從中線切開時,可測得其核衣殼的平均直徑為35±2nm。
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