流行性乙型腦炎病毒的分離和鑒定

  根據乙型腦炎明顯的季節性和地區性及其臨床特征，例如高熱和狂暴或 沉鬱等神 經症狀，流行期中不難作出診斷。但是必須與其它的病毒性、細菌性和中毒性腦炎相鑒別。 由於母豬可能發生流產，公豬可能發生睾丸炎，還需注意與布氏杆菌病、細小病毒病以及生 殖和呼吸道綜合症等鑒別。為了確診，必須進行病毒分離和血清學試驗等特異性診斷。　

　(1) 病毒的分離和鑒定：在動物發熱初期，可采血液或血清分離病毒。動物死後， 應盡快(夏天不得超過2～3小時)采取腦組織分離病毒。各項操作以 及病料的運送，必須遵守“冷藏”和“快速”兩個原則。根據作者等的經驗，如將乳 鼠帶到現場接種，可以明顯提高病毒分離率。　　乳鼠是應用最多的實驗動物，也是多年來實踐證明比較有效的病毒分離動物。 應用腦內皮下同時接種法或在腦內接種的同時，再較大量地作腹腔接種，例如02～0 5ml，常可提高病毒分離率。乳鼠發病時，離群、拒食、抽筋、消瘦， 此時即可采腦作 進一步傳代或鑒定。但需注意，發病乳鼠常被母鼠吃掉，故應及時將母鼠取走。也可將上述材料接種於7～9日齡的雞胚卵黃囊內，2～3天後收獲胚體，再作乳鼠接 種。  近年來常用倉鼠腎原代細胞分離乙腦病毒，即在已經長成單層的倉鼠腎細胞內 加入該培養瓶(管)原營養液量1/5～1/10的接種材料，吸附30～60分鍾後，加入維持液， 繼續置37℃，每天觀察1次，共7天，如發現“＋＋”的細胞病變，即可收獲，供傳代或鑒 定用。倉鼠腎BHK21細胞係也可被用於分離病毒，接種病料後觀察1周後如無CPE出現,可作盲傳。　　即使被檢材料中含有病毒，但在初代接種小鼠或細胞培養物後，往往不見發病或 不出現細胞病變，這是野外毒株尚未適應實驗動物或細胞培養物的緣故。 因此第1代接 種呈陰性結果時，應繼續盲傳2～3代，也就是經一定時間(7～10天) 而尚未發現動物發 病或細胞出現病變時，可按常法撲殺幾個動物采腦，或選取幾瓶細胞培養物作凍融處理， 再作下一代動物或細胞培養物的傳代接種。　　欲由蚊體分離病毒時，用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室內飼養2～3天，待胃血 消化，抗體消失,這樣可以提高病毒分離率。分離時用氯仿將蚊熏死，鑒定分類，並以 25、50或100隻為1批，裝入滅菌的小瓶或試管中。隨後加入2～3ml25%酒精生理鹽水，  充分搖洗5～10分鍾，倒掉酒精液，再用滅菌生理鹽水或Hanks液洗2～3次後，移入玻璃 研磨器內，加入1～2ml05%乳白蛋白水解物或其它稀釋液，磨細後移入離心管，以3 00 0r/min轉的速度離心沉澱20分鍾，吸取上清液，如上加入青、鏈黴素，置4℃感作1小時 後接種動物或細胞。細胞營養液內應加兩性黴素，以免黴菌生長。 Hsu等在台灣南部 收集豬場的蚊，自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000隻，分為1 650批，做成乳劑後 分別接種乳鼠和庫蚊細胞培養物。在庫蚊細胞培養物中分離到68株乙腦病毒，由乳 鼠腦分離到48株病毒，似乎說明庫蚊細胞培養物比乳鼠更適於由蚊體分離乙腦病毒。新分離病毒的初步鑒定按一般方法進行，請參閱本書第十四章。隨後再用乙腦標準 毒株和標準免疫血清與新分離病毒進行交叉補體結合試驗、交叉中和試驗、交叉血凝抑 製試驗。也可應用小鼠進行交叉保護試驗，即用新分離毒株和標準乙腦毒株分別製備 福爾馬林滅活疫苗，給3周齡小鼠皮下接種01～02ml，共2次，間隔7天， 另留部 分小鼠不免疫作為對照。於第2次注射後兩周，用不同稀釋度的標準乙腦毒株攻擊：采用腹 腔攻擊、腦內刺激法，即在腹腔注射病毒的同時，給每隻小鼠腦內注射003ml 生理鹽水或肉湯。觀察3周，記錄各組小鼠的死亡和保護數。如為同種病毒， 則其抵 抗標準乙腦毒株的攻擊量可比對照組高100～1 000倍， 並與以標準乙腦毒株免疫的小鼠 組的保護率相近。　　檢出病畜體內的病毒抗原，是快速診斷的需要，也是國內外正在探索和深入研究的 一個課題。作者等應用固相和液相補體結合試驗、免疫粘附試驗、反向間接血凝試驗、 熒光抗體技術、免疫酶技術、125I放射免疫測定以及反轉錄多聚酶鏈RTPCR反應 等方法檢測乙腦感染小鼠和自 然感染病馬腦內的病毒抗原，都有較高的特異性和檢出率。