正粘病毒化學組成及其功能
流感病毒由68%～70%的蛋白質、1%～2%的核糖核酸(RNA)、20%～25%脂質和5%～8%的糖組成。病毒蛋白質含有5種多肽，即血凝素、神經氨酸酶、基質蛋白、核蛋白和多聚酶。
(1) 正粘病毒基因組組成
〖HT5SS〗流感病毒的基因組是由8個分節段的單鏈、負股RNA組成，其中4、6號兩個節段編碼病毒囊膜糖蛋白，比較而言，丙型流感病毒僅編碼單一表麵糖蛋白，因而丙型流感病毒的基因組由7個RNA節段組成。流感病毒基因組片段具有共同的特點：所有的RNA節段均具有相同的5’端，它由13個核苷酸所組成；3’端由12個高度保守的核苷酸組成，靠近3’端的第四個堿基，有些毒株為U，有的為C。在這些共同序列中，有部分序列可反向互補，這一點對病毒RNA的複製很重要；在每一節段靠近5’端15～21核苷酸處有一保守區，其序列為polyU。這一保守區在病毒mRNA合成時是產生polyA的信號。因為每一RNA節段的3’和5’端有部分序列互補,所以每個RNA節段呈鍋柄環狀。第1～6個節段各編碼一個病毒蛋白，7、8節段則編碼2個病毒蛋白，這樣甲、乙型流感病毒具有10種蛋白多肽，推論丙型流感病毒具有9種蛋白多肽，可目前僅證實8種。核酸具體編碼見表24-3。由於流感病毒的基因組分節段的結構特點，導致了基因組的易變性和具有很高的重組率。流感病毒RNA總分子量為59～63MD。甲、乙和丙型流感病毒基因組的大小和堿基組成不盡相同，AU∶AC的比率甲型為1:25；乙型為1:42；丙型為1:46。提純的流感病毒RNA不具有感染性，需與一些具有多聚酶活性的蛋白結合在一起才具有感染性。
(2) 正粘病毒核蛋白(NP)
流感病毒的核蛋白，分子量約60kDa，是單體磷酸化的多肽，是構成核衣殼的主要成分。核蛋白具有型特異性，根據其抗原性的不同，可將流感病毒分為甲、乙、丙三型，它是可用補體結合試驗方法測定的型特異抗原，即可溶性抗原。它沒有感染性，在病毒粒子內部卷曲成螺旋狀結構，是病毒核酸外麵的一種蛋白質，但它並不把核酸完全包被起來，因而核衣殼仍對核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解後，核蛋白亞單位仍然存在，推測核蛋白自身形成一種內聚結構。核蛋白是一種多功能蛋白質，除了形成病毒的核衣殼外，在病毒基因組的轉錄和複製中也可能起作用。在確定病毒的宿主特異性方麵也有作用，例如根據對許多流感病毒NP基因的研究，可將它們分為5個不同的組，所有的禽流感病毒分為兩個組，馬流感病毒分為兩個組，豬流感病毒分在一個組。核蛋白的磷酸化取決於宿主細胞，與病毒感染的宿主譜有關。核蛋白分子至少具有3個獨立的抗原位點，借助於單克隆抗體和多克隆抗體進行研究，發現所有被測毒株都有一個共同位點，針對這一位點的單抗可抑製病毒RNA分子的體外轉錄。針對核蛋白的單克隆抗體不能給動物提供被動保護，用提純的NP免疫動物，也隻能產生很微弱的抗感染能力，但NP是細胞毒性淋巴細胞識別的主要抗原。
(3) 正粘病毒基質蛋白(matrixproteins,MA)
基質蛋白是一種非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA節段、丙型流感病毒的6RNA節段編碼。非糖基化蛋白存在於囊膜蛋白的內側，也稱為內膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有兩個讀碼框架，可轉錄出兩個mRNA，分別翻譯出一種蛋白質。因此流感病毒的基質蛋白有兩種，即M1和M2。M1由252個氨基酸殘基組成，分子量約26kDa，它是病毒的主要結構蛋白，占流感病毒蛋白總量的40%。這種蛋白也具有型特異性，其抗原性的差異是流感病毒分型的依據之一。M1位於病毒囊膜的類脂雙層內側、核衣殼的外側，是維持病毒形態的結構蛋白。另外M1還可在感染細胞的細胞核、細胞質和細胞膜上發現。研究表明，M1的氨基端含有一親水區，羧基端與病毒的轉錄酶之間相互作用。流感病毒的M1具有多種功能，除維持病毒粒子的形態外，還能調節病毒轉錄酶的活性，另外在子代病毒粒子裝配過程中也起重要作用。據報道，M1單克隆抗體不能給動物提供被動保護。M2由97個氨基酸殘基組成，分子量大約為15kDa，由片段7轉錄的第二個小mRNA翻譯出。M2也是一種跨膜蛋白，主要以四聚體形式存在於感染細胞的細胞膜上，另外也是病毒囊膜上的蛋白組分之一。每個病毒粒子大約含有14～68個M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成過程中作為質子通道控製高爾基體內的pH值；在病毒脫殼時酸化病毒粒子的內部環境；另外在病毒裝配過程中也起作用。流感病毒M2的氨基酸序列很保守，在所檢測的毒株中，其同源性高達90%。這種蛋白在感染細胞的細胞膜上與I類糖蛋白相似，即氨基端在細胞外，羧基端在細胞內。細胞外部分為18～23個氨基酸，19個氨基酸殘基組成的疏水區插入細胞膜內，羧基端的54個氨基酸位於細胞質內。氨基端的10個氨基酸非常保守，在所測的禽流感和人流感病毒中，其序列幾乎完全相同。研究表明，針對M2氨基端的單克隆抗體可抑製病毒蝕斑的增大，其作用方式與抗神經氨酸酶抗體的作用方式相同。用這種單抗篩選突變株時，不僅引起M2的突變，還能引起M1的突變。
(4) 正粘病毒聚合酶(polymerase)
流感病毒的聚合酶由三種成分組成，它們是PB1、PB2、PA。這三種蛋白質是病毒粒子中分子量最大的蛋白質，分別為PB196kDa，PB287kDa，PA85kDa。這三種蛋白質在氨基酸序列上有一共同特點，都含有一特異的親核序列區，其作用是使這幾種蛋白質在胞漿合成後能順利進入細胞核。所以在感染細胞的細胞核內都可發現這三種蛋白成分。流感病毒聚合酶複合體在病毒粒子中所處的位置目前已經清楚。三種蛋白質位於病毒基因組的3’末端，免疫電鏡技術已直接觀察到這一複合體位於每一個核殼體的一端。聚合酶複合體的三種成分分別由不同的基因組片段編碼。PB1由片段2編碼，共757個氨基酸殘基。其功能是在病毒mRNA合成起始後使之逐漸延長；在模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)的合成過程中也靠PB1的作用使合成鏈增長。PB2由片段1編碼，大約759個氨基酸殘基。其作用是在病毒mRNA轉錄的起始階段，識別並結合在5’端I型帽子結構。另外它還具有限製性內切酶活性，參與宿主mRNA帽子結構的切割。PB2在病毒cRNA和vRNA合成過程中的作用還不清楚，因為這些過程不需要宿主mRNA的帽子結構做引物。PA由片段3編碼，由716個氨基酸殘基組成。在病毒RNA轉錄和複製過程中，PA與PB1和PB2在一起隨鏈的延長而移動，因此推測PA與PB1和PB2共同構成RNA聚合酶複合體。但PA在病毒RNA合成過程中的作用還不清楚，有人認為可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白。
(5) 正粘病毒非結構蛋白(nostructuralproteins,NP)
甲、乙型流感病毒的非結構蛋白由片段8編碼，丙型流感病毒由片段7編碼。片段8或7也有兩個讀碼框架，可編碼兩種蛋白質即NS1和NS2，兩者的分子量分別為25kDa和12kDa。主要在胞漿內，在病毒粒子內不存在這兩種蛋白成分。流感病毒非結構蛋白的功能還沒有徹底搞清，可能在病毒複製過程中起一定作用，NS2還可能有調節非結構蛋白合成的作用。在細胞感染流感病毒的早期就可發現細胞核內有大量的NS1聚集，另外還可在細胞漿內發現。NS2合成較晚，主要存在於細胞胞漿，也可在細胞核內發現。序列分析表明，NS1和NS2有70個氨基酸的重疊，並且在氨基端有9個氨基酸是相同的。NS1蛋白含有兩個核定位信號區，其中34～38位氨基酸殘基處的信號區非常保守，在所有甲型流感病毒中都相同。第二個信號區在203～237位氨基酸殘基處，在大多數甲型流感病毒中都有這一序列。野外分離的禽流感病毒的某些毒株，NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失現象。不同亞型毒株的NS在帶電性和磷酸化方麵有很大差異。用多克隆抗血清對NS1的抗原性進行研究，結果發現，不同亞型毒株之間存在明顯的交叉反應。從人、豬、馬分離的甲型流感病毒，其NS1的抗原性非常相似，一般方法難以區分，而禽流感病毒株的NS1其抗原性有變異。
(6) 正粘病毒脂質層
由內、外兩層構成，緊靠於內膜蛋白之外。脂質占病毒粒子總重量的20%～25%，使病毒對乙醚和其它脂溶劑敏感。HA和NA亞單位的疏水性末端即植入於這個脂質層內。流感病毒的脂質與副粘病毒相似，主要來自宿主細胞，由磷脂、膽固醇和三甘油脂組成，其中磷脂和膽固醇占95%以上。
(7) 正粘病毒宿主抗原
在不同種動物細胞中生長的流感病毒粒子，帶有各該動物細胞的宿主抗原。例如，在雞胚細胞中培養的病毒，給家兔進行免疫注射，不僅使其產生抗病毒抗體，而且還能產生抗雞胚細胞的抗體。宿主抗原占病毒總重量的5%，分子量為15kDa，大部分是糖。宿主抗原連結於病毒表麵蛋白上，可能是HA和NA的糖蛋白中的糖組分。抗宿主抗體主要針對宿主細胞的糖。
(8) 正粘病毒血凝素
血凝素(HA)是流感病毒的主要表麵糖蛋白，具有凝集多種動物紅細胞的性質，借助HA對細胞受體的作用，使病毒附著於細胞，在穿膜過程中起關鍵作用。HA具有誘生中和抗體的能力，產生免疫保護作用。HA可以直接通過血凝反應檢測，其抗體可用血凝抑製、中和試驗、補反和ELISA方法來檢測。流感病毒的HA呈三角細長的棒狀構造。HA為75kDa的糖蛋白，可水解成兩個獨立的肽鏈,兩個多肽由二硫鍵連接在一起。HA水解成HA1和HA2是感染的先決條件。HA的變異性很強，是病毒發生抗原變異的主要原因。HA由甲、乙型流感病毒RNA片段4編碼，是典型的I型糖蛋白。它含有4個結構域：信號肽(前導序列)、胞漿域、跨膜域和胞外域。免疫學和生物化學方法研究證明，HA在細胞內質網合成。合成後由內質網運送到高爾基複合體，最後到達細胞膜，嵌入胞膜的脂質雙層，在病毒出芽釋放時被帶到病毒囊膜上。HA在運送過程中經過不斷的修飾，如將N－葡萄糖苷寡糖加到天門冬酰胺殘基上，有些寡糖加上去後還經過進一步修飾。修飾的位置隨毒株不同而有區別。這樣形成的單體HA分布在內質網膜上，在向高爾基體運送過程中，由二硫鍵連接並折疊成一定的形狀，隨後形成三聚體，由高爾基體運送到細胞膜。HA產生後到其發揮作用時，還經過幾個切割加工過程，包括N端信號肽的切除及HA1和HA2的產生。N端的信號肽約由16個氨基酸殘基組成，其作用是識別內質網膜。HA合成後由信號肽酶將這一短肽切除，因此成熟的HA不含信號肽。另一個加工過程是將HA切割成兩條多肽鏈，產生HA1和HA2。切割時去掉一個或多個氨基酸殘基，這與宿主細胞及毒株的毒力有關。HA1和HA2的分子量分別為36kDa和27kDa，兩條肽鏈被一個二硫鍵連在一起，再加上分子內的一些二硫鍵及其它非共價鍵的相互作用，使HA形成一定的立體結構。HA的一級結構〓根據對不同亞型毒株HA的氨基酸序列測定及根據其片段4的核苷酸序列推測，HA大約由562～566個氨基酸殘基組成。在HA的氨基端有一由16個疏水氨基酸組成的信號肽，在加工過程中被信號肽酶切掉。緊接信號肽的328個氨基酸殘基是HA1部分，羧基端的221個氨基酸殘基構成HA2。在HA1和HA2之間有一精氨酸殘基，在加工過程中被切掉。經過切割後產生的HA1和HA2由一個二硫鍵和許多非共價鍵連在一起，兩條肽鏈之間的二硫鍵在HA1的14位和HA2137位的半胱氨酸之間形成。另外在HA1和HA2分子內還有其它的二硫鍵。HA2的羧基端(185～211氨基酸區域)主要由疏水氨基酸殘基組成，HA靠這一部分插入病毒囊膜的脂質雙層。最末端的10個氨基酸殘基多數是親水性的，因此可伸出脂質雙層進入病毒粒子內。HA是一種糖蛋白，每一個HA單體分子上帶有7個寡糖鏈，其中6個在HA1，1個在HA2。這些寡糖鏈都通過N－葡萄糖苷鍵與天門冬氨酸殘基相連。HA中寡糖的總量約占20%，主要由氨基葡萄糖組成，一些甘露糖形成枝狀結構，此外還有少量的岩藻糖，其最外端是半乳糖。在其它病毒糖蛋白的寡糖末端常帶有唾液酸(N－乙酰神經氨酸)，但流感病毒沒有，這是由於病毒粒子含有神經氨酸酶的緣故。 目前對大多數亞型的HA已經測序，通過序列比較發現半胱氨酸殘基在所有亞型的序列中都很保守。這表明它們從一個共同的“祖先”進化而來，並且表明它們的結構都相似。通過部分氨基酸序列的比較發現，H1和H3亞型差別最大，僅25%的同源性；其它亞型之間的同源性較高，H2與H5亞型HA之間序列的同源性最高，為80%；相同亞型的不同毒株之間，HA序列的同源性在90%以上。 HA的三維結構〓流感病毒囊膜表麵的纖突是三個HA聚合在一起形成的三聚體。用去汙劑將病毒粒子裂解後可分離到完整的HA纖突。當把去汙劑除去後，HA分子靠其疏水端聚集在一起形成玫瑰花樣。用蛋白水解酶(如菠蘿蛋白酶)消化某些毒株，可分離到不完整的HA分子。HA纖突由三個HA單體分子組成，單體可分為兩部分，一部分是呈球狀的頭部，含有受體結合位點和抗原決定簇；另一部分為柄，與囊膜相連，長約7.6nm。三聚體的總長為135nm。用X線衍射技術對HA研究的結果表明，HA1的氨基端和HA2的羧基端位於分子的末端，並且靠近囊膜。球狀頭部由HA1組成，莖部由HA2和部分HA1組成。在HA頭部和莖部各單體之間都有局部接觸，這樣使之形成的三聚體更加穩固。
(9)神經氨酸酶(NA)
神經氨酸酶是流感病毒粒子表麵的另一重要抗原。NA可水解細胞表麵受體特異性糖蛋白末端的N－乙酰基神經氨酸。病毒在細胞表麵成熟時，NA可以移去細胞膜出芽點上的神經氨酸，有利於病毒粒子的成熟和釋放。它具有免疫原性，能誘發相應的抗體。NA抗體可以抑製酶活性，並具有免疫保護作用。NA亞單位為四聚體，呈啞鈴狀，外端呈釘帽狀，大小為9×5nm，內端呈結節狀，直徑4nm，像樹根一樣植入於脂質層內，兩端由一長10nm的杆相連。NA亞單位的分子量為200kDa，它是由二個相同的並由二硫鍵連接的55kDa糖蛋白的二聚物，即由4個單體NA所組成，見圖24-4。NA的酶活性可以進行定量測定。HA和NA是甲、乙型流感病毒的兩種糖蛋白，而丙型流感則有一種糖蛋白，即血凝素—酯酶(hemagglutinin－esterase，HE)，具有HA的特性，又具有NA的酯酶活性。但丙型流感不具有NA活性。用去汙劑、脂溶劑或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、鏈黴蛋白酶)處理，可使NA纖突從病毒粒子上釋放下來。通過電子顯微鏡觀察，發現釋放的NA纖突呈蘑菇狀。除掉去汙劑後，這些纖突可通過疏水的莖部聚集在一起呈玫瑰花形。鏈黴蛋白酶處理釋放的纖突，具有完整的酶活性和抗原性。病毒囊膜上的NA纖突是NA單體形成的四聚體，它包括一個蘑菇狀的頭部和一個細莖。
NA是一種糖蛋白，其蛋白部分由片段6編碼。目前對絕大多數亞型毒株的片段6序列已經清楚，並能從基因序列推測出其氨基酸序列。通過對去汙劑處理後釋放的NA進行部分氨基酸序列分析，發現與基因推測的序列很一致。NA蛋白質序列的特點是翻譯後不經過切割；信號肽不被除去；翻譯起始用的蛋氨酸仍然存在；羧基端也不曾經過加工。NA與HA不同，它屬於II類糖蛋白，即氨基端在囊膜內而羧基端在囊膜外，與HA正好相反。NA的一級結構包括4個區域，分別為氨基端胞漿尾、非極性跨膜區、莖部和頭部序列。NA的氨基端胞漿尾包括6個氨基酸殘基。根據目前所檢測的不同亞型的NA序列，發現氨基端胞漿尾非常保守，在所有的甲型流感病毒中都相同。這表明這一序列可能具有重要功能，但其真正功能目前還不清楚。NA的非極性跨膜區包括氨基端7到35位的氨基酸殘基，其中前6個比較保守，其餘23～25個氨基酸變異較大。用去汙劑和鏈黴蛋白酶處理提取NA後進行序列分析，證明非極性跨膜區的作用是將NA固定於脂質雙層；NA合成後在內質網的運輸過程中，這一序列起信號肽的作用。非極性跨膜區的長度在不同的亞型之間有差別。NA的莖部長度及序列在不同的毒株也有很大的差異。莖部的主要功能是幫助形成NA四聚體，當四聚體形成後，用鏈黴蛋白酶可將其莖部切下，而剩餘的四聚體頭部仍可保持正常的結構，並且抗原和酶活性都不受影響。莖部是否還有其它功能，目前還不清楚。NA的頭部序列在不同亞型的毒株有較高的同源性(46%)，這一點與莖部和非極性跨膜區不同。用鏈黴蛋白酶處理將NA莖部和跨膜區除去，獲得NA的四聚體頭部，通過X線晶體衍射技術研究表明，四聚體頭部大小為100×100×60nm，由4個相同的單體構成。每一個單體由6個β折疊組成，每個折疊又由4條反平行排列的肽鏈組成。每個折疊的立體構型都相同，呈螺旋槳葉片狀，按逆時針方向排列。連接β－鏈的莖環結構在不同亞型之間的差異，其氨基酸的變化是造成NA酶活性和抗原性變異的原因。NA酶活性的催化中心位於頭部頂端，呈凹隱狀，每個NA單體都有一個，所以HA纖突具有4個催化中心。研究表明，每個NA纖突有4個抗原位點，每個位點又含有多個抗原決定簇。
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