正粘病毒診斷
根據流感的典型臨床症狀及其高度的接觸傳染性、急性發作和迅速傳播等特點，常可作出初步診斷。但為了弄清是由哪一型或哪一亞型病毒引起的，則必須進行實驗診斷，即必須進行病毒分離和鑒定或作血清學檢查，才能獲得確診，尤其是在首次發現疫情的地區。
(1)病毒的分離和鑒定
A.標本的采集和處理〓病料應在疾病急性期或出現臨床症狀的最早期采取。由於流感的病毒血症時間短暫，且隨動物種類和毒株而異，實驗診斷時一般不以病畜的血液作為病毒分離的材料。但雞患禽流感時，血液中的病毒滴度極高，故可采取病雞血液分離病毒。采集病馬和豬的材料時，最好應用棉拭子醮取鼻道深部或咽部的粘液。禽類可采取氣管或泄殖腔粘液和血液，或者撲殺病禽，直接采取肺或鼻竇滲出物分離病毒。將醮取病料的棉拭子立即放入含青黴素(1000ug/ml)的滅菌肉湯(pH72～76)、Hanks液或生理鹽水中。如有黴菌汙染可能，另加兩性黴素(2～5u/ml)。充分振蕩，使粘液分散，置4℃冰箱內1～2小時，經1500～2000r/min離心沉澱15分鍾後，吸取上清液供接種用。無菌采取的脫纖血可直接作接種用。肺組織應研磨成乳劑。竇滲出物則應適當稀釋，並經抗生素處理。如果不能在24小時內完成接種工作，應將標本置於-20℃下保存。采取急性期和恢複後2～3周的雙份血清，供抗體檢查。
B.接種〓通常應用9～11日齡雞胚，作羊膜腔和尿囊腔同時接種。每胚注入02ml。每個標本接種8～10個雞胚。接種後置35℃孵育。於接種後24小時開始檢查，同時廢棄死胚。此後每隔12小檢查一次，取出死胚，收集其羊水和尿囊液，用雞紅細胞檢查有無凝集性。即取未稀釋的羊水或尿囊液025ml，加入於小試管或血凝滴定板孔內，隨後加入1%雞紅細胞懸液025ml，搖勻後靜置45～60分鍾觀察結果。因病毒在雞胚內初次增殖時，不一定使雞胚死亡，因此要在孵育4天後將剩餘的活雞胚移至4℃冰箱過夜(或置-30℃冷凍1小時)，按上述方法采樣檢測HA，同時用新雞胚進行盲目傳代，如經3～4代仍不出現血凝反應，即判定為陰性。
C.分離物的鑒定〓流感病毒可用血凝抑製試驗、補體結合試驗、中和試驗或血細胞吸附抑製試驗等方法進行鑒定。為此必須製備型特異性免疫血清和株特異性免疫血清。a.免疫血清的製備：型特異性免疫血清(補體結合試驗用)的製備：甲型流感病毒常用甲0型JPR3株，乙型流感病毒常用Lee株。應用這兩株病毒的鼠肺適應株，即將其先經小鼠滴鼻感染幾代，提高其對小鼠的毒力，以能在滴鼻感染後3～5天使多數小鼠發病，且有部分死亡者為宜。用這樣的適應株滴鼻接種一批12～16g小鼠，待其發病並有部分死亡時，解剖小鼠，以無菌手續取肺，製成10%懸液，低速離心沉澱，除去粗大顆粒，吸取上清液，作免疫用抗原。選用300～500g體重的健康豚鼠4～5隻，先由每隻采血3～5ml，分離血清保存，作為免疫前血清，隨後用乙醚輕度麻醉後，以上述感染鼠肺懸液作滴鼻接種，每隻05ml，共3～4次，每次間隔1星期。在最後一次滴鼻接種同時，腹腔注射2ml鼠肺懸液。一星期後試血，如對同型尿囊膜抗原的補體結合效價超過1∶80，而與異型抗原不起交叉反應，即可全采血，分離血清，保存於低溫冰箱中備用。株特異性免疫血清(血凝抑製試驗用)的製備：以特定株病毒接種9～11日齡的雞胚，孵育2～3天後采取感染尿囊液，低速離心沉澱，除去粗大顆粒，測定血凝滴度，應不低於1∶80。血凝滴度過低時，可連續通過雞胚數代後應用。取體重2kg以上的健康雞，先由翅靜脈采血2ml，作免疫前血清用。隨後靜脈注射感染尿囊液2ml，第5天再注射同量的感染尿囊液一次，經7天後試血。如果血凝抑製效價高於1∶160，即可按常規方法采血，分離血清，凍結保存備用。抗體滴度過低時，可再靜脈注射感染尿囊液5ml。試血和采血時間的間隔應不超過一天，以免抗體滴度下降。b.鑒定方法：型特異性補體結合試驗：已知流感病毒有甲、乙、丙三型。這三型病毒各有其特異的可溶性抗原。將新分離的病毒接種於雞胚尿囊腔中。如果尿囊液的血凝滴度在1∶40以上，即可采取尿囊膜，用生理鹽水洗滌3次，剪成數塊，放入試管中。按每個尿囊膜加1ml滅菌生理鹽水，置低溫酒精中冰凍，隨後再置室溫中融化，如此凍融3次。而後，經3000r/min離心沉澱15分鍾，吸上清液，加1∶10000硫柳汞防腐，保存於普通冰箱中，可用一個月。將上述抗原作1∶2、1∶4、1∶8……直至1∶256的稀釋，與甲、乙、丙三型免疫血清進行交叉補體結合試驗。各型血清的用量均為4單位。有關補體結合試驗的具體操作術式，請參見本書相關章節。必須指出，動物流感病毒，例如馬流感病毒、豬流感病毒和禽流感病毒，都是甲型流感病毒。因此，進行型特異性補體結合試驗的主要目的，就是確定所分離的病毒是否確係流感病毒。株特異性血凝抑製試驗：流感病毒能凝集20多種動物的紅細胞，但在血凝和血凝抑製試驗中最常用的是雞和豚鼠的紅細胞。先測定新分離病毒的血凝滴度，並於試驗前配製4單位HA，與不同稀釋度的各株免疫血清分別進行血凝抑製試驗。株特異性免疫血清，對同株或同一亞型的病毒呈現明顯的血凝抑製作用，通常與其原測定的效價相同或接近。而對不同亞型的病毒則不呈現明顯的血凝抑製反應。血凝抑製試驗是流感病毒鑒定中最常應用的方法，但也有些問題需加注意，例如不同毒株與抗體的親和力不同，不同毒株對多種正常血清中的非特異性抑製物的敏感性亦有所不同。由於甲型流感病毒，特別是人的甲型感病毒不斷地發生抗原性變異。為了確切地了解抗原變異的幅度，經常應用交叉血凝抑製試驗進行抗原分析。所用的免疫血清包括以往流行過的代表株、當前流行的代表株以及新分離的毒株所製備的免疫血清。所用的抗原是與上述免疫血清相應的各株抗原。具體操作方法同血凝抑製試驗。將每個免疫血清對所有的抗原都做一次血凝抑製試驗。每個抗原均需準確地調節為4個或8個單位。由於血凝抗原易於失效，整個交叉血凝抑製試驗應在同次同一條件下進行。根據試驗結果，按下式計算抗原比：〖WB〗r=〖KF(〗r1×r2〖KF)〗〖DW〗r1=〖SX(〗甲血清對乙抗原的血凝抑製滴度〖〗甲血清對甲抗原的血凝抑製滴度〖SX)〗〖DW〗r2=〖SX(〗乙血清對甲抗原的血凝抑製滴度〖〗乙血清對乙抗原的血凝抑製滴度〖SX)〗“r”代表兩個毒株之間的抗原差別。r值等於1，表示兩毒株之間完全相同，是同一亞型病毒。r值愈大，兩毒株的差異也愈大，亦即它們之間的類屬關係愈小。值在4以上時，表示兩毒株之間的差異顯著，例如：〖DW〗r=〖KF(〗〖SX(〗1/20[]1/60[SX)]×[SX(]1/20[]1/640[SX)][KF)]=[KF(]256[KF)]=16上述結果說明，甲毒株和乙毒株在抗原性上具有非常明顯的差異，很可能屬於不同的亞型。中和試驗：流感病毒可用雞胚或細胞培養物作中和試驗進行鑒定。一般應用定量病毒和不同稀釋度血清的方法，即先將病毒在雞胚或組織培養細胞中滴定。根據接種72小時雞胚尿囊液的血凝終點或接種7天後組織培養細胞上的紅細胞吸附終點，計算出雞胚半數感染劑量(EID50)或組織培養物半數感染劑量(TCID50)。中和試驗時應用的病毒量為100個EID50或100個TCID50。免疫血清經預先除去非特異性抑製素後，連續的倍倍稀釋，加入病毒懸液並經混合後，放室溫靜置1小時，每個雞胚或每個細胞管接種02ml。每個血清稀釋度接種4個雞胚或4管細胞，於33～35℃孵育3～7天。檢查雞胚尿囊液血凝性或組織培養細胞的吸附性。能夠中和病毒，使雞胚尿囊液不出現血凝或組織培養細胞不出現紅細胞吸附現象的血清最高效價的中和反應，通常與預測的該免疫血清的中和滴度相同或相近。不同亞型病毒與相應免疫血清之間呈現最高效價的中和反應，通常與預測的免疫血清的中和滴度相同或相近。不同亞型病毒和免疫血清之間，通常不呈現明顯的中和反應，中和滴度較低或很低。免疫熒光技術：主要用於病料內流感病毒的快速檢出，分直接法和間接法兩種。應用上述甲、乙、丙三型的型特異性免疫血清，其補體結合效價應在1∶320以上。提純IgG後，標記異硫氰酸鹽熒光素(FITC)，即為直接免疫熒光染色劑。也可應用流感免疫血清作為第一抗體，以抗相應動物IgG抗體的熒光染色劑作為第二抗體，進行間接法染色檢測。有關IgG的提取、FITC標記與鑒定以及染色方法等，請參閱本書有關章節。將醮取鼻咽部分泌物的棉拭子，涮洗在10%犢牛血清Hanks液中，經2000r/min離心沉澱20分鍾後，取沉澱物塗片，吹幹，用冷丙酮固定10分鍾，室溫幹燥後，以磷酸鹽緩衝鹽水漂洗，而後進行熒光染色。也可將上述感染材料的懸液離心沉澱後，取上清液接種組織培養細胞，孵育16小時後，進行熒光染色。如係接種雞胚，則於接種後2～3天采集羊水和尿囊液，離心沉澱，再以沉澱物塗片，進行熒光染色。瓊脂擴散試驗與對流免疫電泳：主要用於新分離毒株的型和亞型的鑒定、抗原關係分析以及動物血清的診斷。由於瓊脂擴散試驗的敏感性較低，再因完整的流感病毒粒子不易透過瓊脂凝膠，所以必須先將病毒濃縮提純，再用某種去汙劑(SDS，SSS，NP40或TritonX100)，將其裂解並適當濃縮後，才能作為抗原。並用單因子血清，例如抗HA血清、抗神經氨酸酶血清、抗內膜蛋白血清、抗核蛋白血清等作為抗體。同時設置各標準毒株作為對照，根據沉澱線融合或交叉，判定被鑒定毒株與標準毒株之間的抗原關係。由於瓊脂擴散試驗的敏感性較低，近年有人試用對流免疫電泳，取得了良好的結果。神經氨酸酶及其抑製試驗：流感病毒NA及抗體的測定，有助於亞型抗原鑒定、NA抗原漂移分析以及人群和動物群中的抗體調查。NA能使粘蛋白分解為N—乙酰神經氨酸。在酸性條件下，高碘酸使NA的碳鏈斷裂，並可與硫代巴比妥酸形成色團，用酸化丁醇提取後，以分光光度計比色，計算NA含量。先將標準免疫血清用生理鹽水作1∶5稀釋，56℃30分鍾滅活後2倍連續稀釋，分別加入1個酶單位的被檢病毒和蛋白底物溶液，37℃感作2～3小時，以下步驟同NA測定試驗。抑製50%酶活力的血清稀釋度為NA抑製滴度。病毒RNA凝膠電泳：因甲型流感病毒的基因組由8個片段組成，可在凝膠電泳中出現8條帶。不同亞型毒株的RNA凝膠電泳圖譜存在差別。病毒發生變異時，電泳圖譜也有改變。因此，RNA凝膠電泳是分子水平上分析毒株關係和變異的新方法。先將病毒濃縮提純，提取RNA，置於含尿素的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，隨後用硝酸銀染色，觀察各片段的遷移率及其與標準毒株的比較。馬甲1和馬甲2流感病毒是遺傳穩定的甲型流感病毒亞型，迄今沒有發現明顯的變異。因此，從馬分離獲得病毒以後，即可應用甲1和甲2兩個亞型的標準血清進行血清學試驗。
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