狂犬病疫苗診斷

 

 (1)標本采取：采取瀕死期瘋動物或死於狂犬病患者屍體的延腦、海馬回、脊髓和唾液腺，置滅菌容器，在冷藏條件下運送至實驗室。如係唾液或脊髓液，則應低速離心後，取上清液，加入青黴素(1000U/ml)和鏈黴素(1000μg/ml)，並酌量加入滅活牛血清，約2%。標本的運送和保存，要求及時、冷藏，以保證診斷準確可靠。腦組織標本分作三份：一份作壓印片，供顯微鏡和熒光抗體檢查或酶聯免疫吸附試驗用；一份用10%甲醛溶液浸泡，作病理學檢查；一份作病毒分離用。如果組織已經腐敗變質，則隻能作病毒分離。

(2)壓印片檢查：切取海馬回，置吸水紙上，切麵向上，用載玻片輕輕按壓切麵，製成壓印標本，室溫自然幹燥後染色鏡檢——檢查特異包涵體，即涅格裏氏小體。染色時，在已固定的標本上滴加染色液(4%堿性複紅飽和無水甲醇溶液3.5ml,2%美藍飽和無水甲醇溶液15ml,無水甲醇35ml依次混合而成)數滴l8～10秒，流水衝洗，待幹後鏡檢。涅格裏氏小體位於神經細胞胞漿內，直徑3～20μm不等，呈梭形、圓形或橢圓形，呈嗜酸性著染——鮮紅色，但在其中常可見到嗜堿性(藍色)小顆粒。神經細胞染成藍色，間質呈粉紅色，紅細胞呈橘紅色。如果檢查小鼠腦內的包涵體，必須注意與其它病毒感染引起的胞漿內包涵體相區別，後者大小均勻，不象涅格裏氏小體那樣大小懸殊。檢查狗腦時，應注意與偶而存在的犬瘟熱病毒引起的包涵體區別。檢出涅格裏氏小體，即可診斷為狂犬病。但是必須指出，並非所有發病動物腦內都能找到包涵體。狗腦的陽性檢出率為70%～90%，人腦約70%。

(3)熒光抗體檢查：如上製造壓印片2張，待幹後，於-20℃用丙酮固定4小時後應用。高免血清是用固定毒多次接種家兔、豚鼠或綿羊而製備的。按常規法提取IgG，並標記熒光素，測定最適稀釋度後應用。近年來常采用抗狂犬病毒單克隆抗體進行標記。病料檢查通常按阻斷對比法進行，即取3～5倍濃度的工作價熒光抗體(如某批熒光抗體的工作價為1：20稀釋度，則取其4～7倍稀釋液應用)，分裝於2支小試管內，分別等量加入正常鼠腦懸液及狂犬病毒感染鼠腦懸液。37℃感作30分鍾。中間振蕩數次,此後離心沉澱,吸取上清液應用。分別滴加1～２滴於上述2張壓印片上,37℃　30分鍾。用pH7.2PBS泡洗10分鍾，然後用緩衝甘油封載後鏡檢。如果以正常鼠腦懸液吸收的熒光抗體染色的壓印片呈特異性熒光(胞漿內亮黃綠色的熒光顆粒或熒光斑塊)，而以感染鼠腦懸液吸收的熒光抗體染色的壓印片不出現特異性熒光染色，即可確診為狂犬病。也可以將腦組織印片或塗片或作病理切片，固定後，滴加熒光標記抗體，感作處理後鏡檢。如有翠綠色顆粒或斑塊熒光即可確診。此外，可以將特異性抗體包被在載體玻片上，用腦或唾液上清與抗體反應後，再用熒光抗體染色，鏡檢。還可采用間接熒光免疫技術進行檢測。熒光抗體檢查必須設置已知陰、陽性標本對照,鑒定特異性。

(4)酶聯免疫吸附試驗：先用抗狂犬病毒陽性血清或IgG包被40孔板，加待測腦懸液，再用標記HRP的陽性IgG進行反應。亦可采用特異性抗體作為一抗與被檢樣品反應，然後再與酶標二抗進行反應。同時，設陽性及陰性抗原對照，如被測樣品出現特異性顯色，即可診斷為狂犬病。