將基因克隆入AdEasyTM轉移載體

 

  AdEasyTM係統中有2種轉移載體可供進行重組腺病毒構建：pShuttle和pShuttle-CMV，這2個載體都含有多克隆位點（MCS）供插入基因。Shuttle不含有啟動子和多聚腺苷酸位點（polyA），允許插入含特定啟動子和polyA位點的表達盒。pShuttle-CMV含有單拷貝CMV啟動子和polyA位點供基礎表達和高表達重組蛋白，你隻需將目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位點。表1提供了各轉移載體的特性。   

表1 AdEasyTM轉移載體特性

載體名稱 克隆能力 啟動子 polyA位點 克隆位點 線性化位點 說明

pShuttle 7.5kb — — MCS 共轉化位點PmeI（ECoRI） 

轉染位點（PacI） 將完整的表達盒裝入多克隆位點（MCS） 

pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共轉化位點PmeI（ECoRI） 

轉染位點（PacI） CMV啟動子能在大多數哺乳動物細胞中高效表達蛋白

 

4.1.1 克隆的一般原則

AdEasyTM轉移載體的特殊設計使其極易在克隆中應用，但在設計克隆策略時應考慮以下因素：

1） 在BJ5183中進行共轉化之前必須將轉化載體線性化。確證表1中所列的線性化位點不存在於插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI線性化時，需要用RecA輔助的限製性內切酶進行酶切。如果插入基因含有所有線性化酶切位點，那麽必須進行定向突變。

2） 重組腺病毒質粒在轉染QBI-293A細胞之前也必須用PacI進行線性化。同樣，插入基因中不能含有PacI位點，如果有則必須進行定向突變。

3） 克隆能力是指質粒載體能夠克隆並且不影響病毒增殖能力的插入基因的最大長度。各轉移載體的克隆能力見表1，建議插入基因的長度最好不超過它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分別插入大於7.5kb和6.6kb的基因將大大降低整個係統的效率。盡管也可能得到重組子，但可能會發生DNA重排，生長速度也將減慢。

 

4） 如果要插入多個表達盒，應避免以頭對頭方向插入相同的元件（如CMV啟動子），否則同源重組時兩個元件之間的部分可能會發生丟失。 

5） 在進行構建腺病毒之前最好測定重組蛋白的暫時性表達。這裏沒有提供詳細的操作方法，但在CMV或其它強力啟動子控製下的基因很容易進行暫時性表達實驗。但某些啟動子控製下的蛋白表達水平在無病毒增殖時可能不足以達到檢測水平。

 

6） 載體DNA可用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心或親和柱法進行純化。我們不主張用小量粗製的DNA進行轉化和轉染實驗，因為汙染的DNA將大大降低菌落和空斑的形成數。

 

4.1.2 構建重組AdEasyTM轉移載體

構建重組AdEasyTM轉移載體的一般指導如下，但我們建議對於詳細的克隆技術和操作方法還需參考通用的分子生物學手冊。 

1． 若cDNA含有位置正確的粘性內切酶位點，則可將它直接克隆入轉移載體。如果沒有，可以使用鈍末端內切酶位點，也可用含合適的酶切位點的引物進行PCR或連接含有酶切位點的接頭使cDNA產生新的酶切位點。PCR插入酶切位點的方法較快速，但對於長cDNA則應使用連接接頭，因為在擴增過程中Taq酶可能會使序列的某些位點發生突變。

2． 插入基因的鑒定可以用限製性內切酶分析或PCR的方法。

3． 轉化之前用PmeI或EcoRI將轉移載體重組子線性化，消化應盡可能徹底，以減少背景信號。

4． 瓊脂糖凝膠上觀察消化產物，若消化已完全，放入65℃ 20分鍾進行滅活。

5． 凝膠純化線性化載體。盡管膠純化可能會降低轉化效率，但不完全消化往往產生較高的背景，從而降低重組率。將線性化質粒去磷酸化也有助於降低背景信號。