AdEasyTM重組子轉染QBI-293A細胞

 

  注意：培養細胞前先參閱5.1章中有關QBI-293A細胞培養的內容。磷酸鈣技術中的注意點：  

無菌在整個過程中保持所有成分的無菌是至關重要的。昆騰公司提供的試劑盒中所有成分均是無菌的，但使用者還必須保證所用其它試劑也均為無菌。 DNA純度  磷酸鈣轉染中所用的DNA必須是高純度的，一些DNA汙染物對培養的細胞具有很強的毒性，那些成功轉染的細胞往往會被汙染物殺死。沉澱時間以前的資料都建議磷酸鈣- DNA共沉澱顆粒在加入細胞和培養液之前至少應反應20分鍾。然而與此相反，最近的研究（Jordan等，1996）顯示長時間共沉澱會形成聚合沉澱塊，從而降低轉染效率。因此，建議共沉澱成分混合後1分鍾即可將沉澱加入細胞培養板。這一時間上的調整可產生小而穩定的沉澱，能更有效地被細胞攝入。

 

4.4.1 細胞鋪板

每塊板都用DMEM5%進行培養，這樣細胞在鋪板後第二天即可達到70%匯合率。由於共轉染是通過細胞表麵完成的，因此轉染時細胞必須是分離的，而不是匯合的。

 

1． 轉染前一天以7.5×105 QBI-293A細胞在60mm培養皿中鋪板，用DMEM5%培養，第二天的細胞數應達到1.0~1.5×106。37℃ CO2孵箱中培養。CO2孵箱有助於保持合適的PH，培養皿在不進行操作時必須始終保存在CO2孵箱中。

2． 轉染前3-4小時換成新鮮培養液，以保證在轉染過程中細胞具有超常的生長力。將培養皿放回CO2孵箱中。  

4.4.2 磷酸鈣轉化技術 

1． 每個轉染都必須用5ug無菌的線性化重組腺病毒DNA。

2． 標記一個1.5ml離心管為編號1。用微量移液槍加入169ul無菌水和5ul 2M氯化鈣溶液。上下吸打二次混勻，然後一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化鈣，再用移液槍慢慢吹打混勻。此時緩衝液的體積為250ul，含有0.25M氯化鈣和5ug DNA。

3． 準備第2管離心管（編號2），加入250ul 2×HBS緩衝液。 

4． 用1ml移液槍吹打2號管中的溶液形成氣泡，在吹打的同時逐滴加入1號管的溶液。加完後繼續吹打5秒以使其完全混勻。這一步驟對於形成的共沉澱顆粒的大小至關重要，小顆粒轉染效率更高，而吹打可以形成較小的顆粒。等一分鍾後再加入細胞培養皿內。

5． 在超淨台內將磷酸鈣-DNA共沉澱混合物逐滴加入到培養皿中，覆蓋範圍盡可能廣。培養液稍後即會透明，十字形晃動培養皿使沉澱均勻分布。

6． 培養皿放入孵箱培養過夜。4小時後，沉澱顆粒在200×倒置顯微鏡下應清晰可見，尤其在無細胞的培養皿表麵。

7． 第二天，去除含共沉澱顆粒的培養液，用PBS製備的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：轉染後細胞都十分脆弱，容易脫壁。清洗時應十分輕柔，將PBS沿培養皿壁加入，然後輕輕旋轉培養皿。用移液槍反複將培養液直接加在細胞上，即可使細胞脫落，然後收集。由於這一時期細胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。