腺病毒感染力測定

  這一實驗的目的是確定腺病毒是否能將DNA轉導入293之外的某一細胞株。該實驗至關重要，因為它將確定腺病毒是否可應用於這個細胞株，以及如果能應用則需要多少的病毒量（也就是需要大量擴增的程度）來完成整個研究。這個實驗中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ則檢測β-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP則檢測GFP。這些高滴度的產品都可單獨向昆騰公司購買。本實驗的陽性對照（β-半乳糖苷酶檢測）亦可向昆騰公司購買，但由於病毒滴度太低而不適於直接進行實驗，通常需要擴增以達到理想的病毒滴度（擴增步驟見5.6）。   腺病毒轉導的效率各個細胞株都不太一樣，其中尤以淋巴細胞株最難轉導。

腺病毒感染力測定通常在多孔板中進行，MOI為1~200，當測定淋巴細胞株時MOI可至1000。對大多數細胞株來說，1~50的MOI值可將報告基因轉入所有的細胞而不會出現任何的毒性。在高MOI情況下，某些病毒蛋白的高表達可對某些細胞產生毒性。無論MOI為多少，感染時都必須用最小的培養液體積並不斷晃動，以使感染效果達到最佳。

1. 按5.2.1中所述方法在6孔板中用不同數量病毒感染細胞（合適的MOI範圍），培養48小時。

2. 進行X-gal染色（見下述）。注意細胞與病毒培養後不必清洗細胞，在整個實驗過程中讓病毒留在培養液中。

 

5.4.1 X-gal染色 

1. 棄去培養液，用37℃預熱的PBS衝洗一遍，然後加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆蓋細胞，0.05%戊二醛室溫孵育5~15分鍾或2%多聚甲醛室溫孵育60分鍾。

2. 棄去固定液，室溫下用PBS徹底洗3遍：第一遍將衝洗液立刻棄去，第二、第三遍則讓衝洗液保留5分鍾。

3. 加入最小體積的X-gal溶液。  

4. 37℃孵育1至12小時（過夜），陽性細胞將被染成藍色。染色完成後可將培養板置於4℃保存。

溶液： 

a） 戊二醛固定液 

使用前將戊二醛用PBS稀釋至終濃度為0.05%。

b） 多聚甲醛固定液 

1. 將2g多聚甲醛溶解在50mL預熱至55℃的水中。

2. 加入2滴10 N NaOH，溶液將變澄清。

3. 待多聚甲醛溶解後，加入10mL 0.2M 磷酸二氫鈉（2.76g/100mL）和40mL 0.2M 磷酸氫二鈉（無水，3g/100mL）。  

4. 固定液在37℃條件下加入，在室溫下固定。多聚甲醛固定液可在4℃最長保存一個星期。

c） X-gal溶液

用PBS製備（PH7.4）：

20 mM氰鐵酸鉀 ( K3Fe(CN)6 )

20 mM氰亞鐵酸鉀 ( K4Fe(CN)6•3H2O )

2 mM MgCl2或MgSO4

使用前加入X-gal儲存液（20mg/mL溶於N,N-二甲基甲酰胺），終濃度為1mg/mL。