腺病毒純化包括3步：
1． 不連續氯化銫密度梯度離心去除主要的細胞汙染物和缺陷性病毒顆粒。
2． 連續氯化銫密度梯度離心將感染性病毒顆粒和缺陷性病毒顆粒分開。
3． 透析去除氯化銫（去鹽）。
連續密度梯度需要過夜離心。為保證時間安排，建議從早上開始第1步，這樣大約在午後就可開始過夜離心。按照此時間安排，完整的一個純化過程包括去鹽在內大約需2天時間。
下麵所有操作均以SW28轉子30ml離心管為例。理論上講，溶液體積調整後也可用其它大小的離心管，切記在離心後收集病毒帶。由於有些汙染物和成熟的病毒顆粒密度相近，因此這二條帶之間的距離很小。在大直徑的離心管中，病毒帶更細，離原始位置更遠，這樣，病毒帶在30ml離心管中比在12ml的管中更易分辨。
5.5.7 不連續密度梯度離心
注意：為確保氯化銫密度梯度後較易分辨病毒帶，擴增病毒至少需要3×108細胞。
1． 預冷離心轉子至4℃。
2． 在離心管中緩慢加入8ml 1.4g/ml氯化銫（53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9），再非常輕緩地加入6ml 1.2g/ml氯化銫26.8+92ml10mM Tris-HCL，PH 7.9）。病毒最終的純度有賴於密度梯度的質量。
3． 超淨台中在不連續梯度頂部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必須少於109細胞中所得的，否則將超過密度梯度負荷量。如果保存液的體積少於20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL調至20ml。
4． 平衡離心管，100000×g（SW28轉子上為23000rpw）4℃離心90分鍾。
5． 超淨台中取出離心管，用夾子直立固定離心管。
6． 用10ml移液器從梯度頂部吸去大部分雜質。
7． 在離心管外壁的穿刺點上貼上膠帶，以防止在穿刺過程中有液體泄露。
8． 用帶18G針頭的5ml注射器從離心管外壁稍低於病毒帶（最下的一條帶）的位置進行穿刺。
注意：感染性和缺陷性病毒顆粒之間的區域通常較渾濁，切勿吸取這一渾濁區。
9． 小心抽吸病毒帶，避免吸到其它帶和雜質，拔出針頭。
10． 取出針頭，將含病毒的溶液轉移至無菌15ml離心管。
11． 加入1倍體積1×TE，這一步對於把溶液密度降低至1.2以下是必須的，病毒帶的密度大約為1.345。
5.7.2 連續密度梯度離心
1． 使用連續密度發生器將12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化銫連續密度梯度加入離心管中。
2． 非常緩慢地在密度梯度頂部加入8-10ml 5.7.1第11步中稀釋的病毒懸液。
3． 100000×g 4℃離心16-20小時。
4． 超速離心後，連續梯度溶液和不連續梯度溶液同樣分層，但底部沒有沉澱，因此通過底部穿刺即可獲得感染性病毒帶。溶液上部（含細胞成分）通常更為幹淨，大部分細胞碎片已通過第一步不連續梯度離心被去除了。
5． 用10ml移液器從離心管頂部吸去大部分梯度溶液和雜質，避免吸到底部含病毒的藍白色條帶。這有助於在收集病毒時降低溶液流出速度。
6． 用20 G針頭從底部穿刺收集底部藍白色病毒帶。
7． 讓底部梯度溶液流入燒杯，當接近病毒帶時再轉入50ml離心管中收集。
8． 藍白色病毒帶收集完後再將剩餘的梯度溶液轉入燒杯。
說明：當然，病毒帶也可以象不連續梯度時一樣從側壁穿刺收集。
5.7.3 病毒溶液去鹽和濃縮
氯化銫是通過透析去除的，這一步至關重要，因為高濃度氯化銫可能會影響病毒對細胞或組織的感染。透析液的選擇取決於病毒的最終用途。如果用於動物，則應避免使用甘油，因為含有甘油的溶液極難注射；如果要使病毒滴度達到5×1011vp/ml，則應避免PBS-5%蔗糖緩衝液，因其不能提供良好的病毒穩定性，由於溶液PH的關係，病毒將會沉澱下來。含10mM Tris（PH8.0），2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒緩衝液可允許病毒濃縮至1013vp/ml，並且具有良好的穩定性。（Nyberg-Hoffman等，1999）。 將病毒帶在分子篩為25000道爾頓的纖維素酯膜中進行4℃透析，去除氯化銫鹽。由於病毒分子量較大，大小約90nm，因此不能穿過透析膜。緩衝液的體積應為病毒溶液的200倍，每次透析一小時，然後更換緩衝液，3次更換緩衝液後應已無痕量氯化銫。透析後的病毒溶液可在-80℃中長期保存，-20℃中則可保存較短時間。需要注意的是腺病毒在反複凍融後感染力將減弱，因此可將病毒分裝成小份，一部分進行滴度測定（5.8：病毒滴度測定），剩下的用於以後的實驗。如果透析後病毒溶液太稀，Millipore公司的超純濃集柱可將病毒濃度提高10倍。這個過程中所丟失的病毒量小於10%。純化柱在使用前必須用70%乙醇消毒，然後在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒緩衝液）。
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