6.1 QBI-293A細胞培養
表現 可能原因 解決方法
細胞高死亡率/細胞脫壁/培養液發黃 支原體、細菌或酵母菌汙染 1） 複蘇一管新的細胞
2） 使用抗生素如鏈黴素和青黴素
細胞生長困難 a) 細胞太少 QBI-293A細胞傳代時至少為5%匯合率，以保證其在一定時間內恢複生長
b) 細胞密度過高 QBI-293A如果經常培養密度過高，則有產生突變的危險，細胞匯合率切勿超過70%
6.2 感染力測定
表現 可能原因 解決方法
感染後細胞高死亡率 a） MOI過高 降低MOI
b） 細胞內含有內源性病毒（野生型腺病毒可產生輔助病毒樣作用，使非重組腺病毒也能感染細胞） 更換凍存的細胞，初代培養的較適用 ;
c） 一些細胞株有類似E1區活性 若一定要使用該細胞株,改用較低MOI
不感染 a) MOI太低 1) 嚐試不同範圍MOI。對於293之外的細胞株，MOI一般為1~200，對於某些難於感染的細胞株可能需要更高
2) 如果使用的是Infect+陽性對照，儲存液在應用之前首先應擴增
b) 感染條件不夠優化 1）任何感染試驗都需以293細胞為陽性對照
2）以未感染的293作為陰性對照來監測細胞培養條件
c) 一些細胞可拮抗腺病毒的感染,需要很高MOI 聯係技術支持（info•qbi.com）
6.3 轉移載體克隆
表現 可能原因 解決方法
轉化大腸杆菌後無菌落形成 a） 抗生素應用不當
b） 轉化效率差 .
c） 製備的質粒質量差 使用50ug/ml卡那黴素
確證細胞是否具有轉化活性
用氯化銫或其它方法純化質粒
轉化後有太多菌落形成 培養基中無抗生素 培養基中加入卡那黴素
篩選的克隆中無目的基因 a） 不匹配粘末端連接
b） 鈍末端連接導致無轉化
c） 連接頭太短，不能被有效切割
d） Taq酶在PCR片段末端產生太多突出性腺嘌呤 確證酶切後DNA粘末端是否匹配加大連接酶量，確證克隆位點已正確應用，Klenow進行鈍化 確證連接頭之間有足夠的堿基對以供正確酶切。詳細信息可向內切酶供應商查詢
Taq酶在PCR產物3’末端可產生一個額外的腺嘌呤。必須移去這個額外的腺嘌呤（可用Klenow）或者使用產生鈍末端的溫度穩定性聚合酶
轉移載體重組子的分子量不正確 使用了錯誤的載體或克隆基因 cDNA用膠純化，確保連接前無其它載體汙染
限製性內切酶無法切割質粒 a） 甲基化
b） 酶已失活
檢驗切割的序列是否對甲基化敏感，若是，則在對甲基化不敏感的細菌如GM33中擴增質粒使用新鮮的酶和製造商推薦的緩衝液
6.4 在BJ5183細胞中共轉化和重組
表現 可能原因 解決方法
菌落少或無菌落 a) 轉化效率不夠
b) 抗生素使用錯誤或濃度過高
c) 製備的質粒質量差
d) 細胞轉化活性
e) 使用了錯誤的細菌株 1） 按照試驗盒說明書進行操作，這是一個關鍵步驟，必須使用最優條件
2） 向電穿孔儀製造商查詢適用於這一細胞的特定操作方法
抗生素為50ug/ml卡那黴素
1） 用氯化銫或其它方法純化質粒
2） 膠純化可降低背景菌落的形成，但也可能降低了轉化效率。當轉化效率太低時避免使用膠純化
1） 試劑盒中提供的細菌都具有電穿孔轉化活性，如果使用其它方法進行轉化，則必須將細胞製備為化學轉化活性
2） 細菌必須正確保存以免喪失轉化活性，參照推薦的方法保存
使用試劑盒中提供的BJ5183細菌株，DH5α僅供用於重組子的擴增，因其無重組活性。
菌落過多 a) 轉移載體和病毒DNA的比率過高 I^1,
b) 轉移載體用PmeI線性化不完全
c) 卡那黴素質量差或量不夠 1） PmeI消化後用膠純化或去磷酸化質粒
2） 共轉染時減少轉移載體的量，推薦比率為：1ug轉移載體:0.1ug超螺旋DAdEasy-1 DNA
PmeI酶切時減少DNA量，檢查內切酶是否具有活性
使用新鮮的卡那黴素，濃度為50ul/ml
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