豬細小病毒(Porcineparvoviurs)同義名：豬細小DNA病毒
豬細小病毒(PPV)是Mary和Mahnel於1966年進行豬瘟病毒組織培養時發現的，並認為是培養細胞內潛伏感染的病毒。隨後相繼從一些正常豬腎細胞培養物和感染豬瘟病毒的豬腎細胞中發現直徑為22～23nm的病毒粒子，並認為與Kilham(1959)發現的大鼠細小病毒相似。通過核酸鑒定證明為DNA型。Cartwright等(1967)在對豬的不孕症和流產、死產的病原學研究中，從病料中分離出了豬細小病毒，從而首次證明了它的致病作用。通過血清學鑒定證實，所有上述分離毒株，包括從一些傳代細胞係中分離的類似病毒均與PPV同屬一型，盡管名稱各異。從六十年代中期分離病毒和逐步明確其致病作用以來，已相繼從歐洲、美洲、亞洲等很多國家分到病毒或查出抗體。它在豬群中檢出率甚高：如美國一些豬群的血清抗體陽性率達50%～80%，丹麥12%～42%，澳大利亞52%，英國19%～56%，德國54%。在日本，據估計約10%的豬流產是由本病毒引起的。我國已先後在北京、上海、吉林、黑龍江、四川和淅江等地分離到了PPV，血清學調查的陽性率為80%。
〖BT4〗1.形態和理化學特性 病毒外觀呈六角形或圓形，無囊膜，直徑20～23nm，二十麵體等軸立體對稱，衣殼由32個殼粒組成。核心含單股線狀DNA，分子量為14×106,G＋C＝48%。DNA分子量約占整個病毒粒子分子量(53×106)的265%。病毒粒子在氯化銫中的浮密度為137～139g/cm3，沉澱係數為105S。〖KH4〗〖JZ〗〖HT5”SS〗圖37-2 豬細小病毒的免疫〖WB〗電鏡(橫杠=100nm)〖DW〗——自楊盛華〖HT5SS〗 與多數細小病毒一樣，PPV對加熱具有強大的抵抗力。據Cartwright等的試驗資料(1967)，當56℃30分鍾加熱處理時，無論病毒的傳染性還是凝集紅細胞的能力，都無明顯改變。在70℃經2小時加熱處理後，其感染力雖有所下降，但並不喪失。但80℃經5分鍾加熱即可使其失去活性。病毒對酸有較強的抵抗性，在pH3～9間穩定。 病毒對乙醚、氯仿等脂溶劑有抵抗力。短時間的(如1小時)胰酶處理對病毒懸液感染性不僅沒有影響，而且能提高其感染效價，這可能是由於胰酶使病毒粒子在懸液中進一步分散的緣故。 組織培養的病毒懸液或保存在pH9甘油緩衝鹽水中的病毒，在－20℃和－70℃下，經一年以上的保存，無論其感染效價和血凝性都不減弱。
〖BT4〗2.血凝性PPV能凝集鼠、豚鼠、恒河猴、雞、鵝和人O型紅細胞。75℃以上加熱處理後，病毒的血凝效價幾乎完全消失。弱酸性到中性的介質適於血凝特性的保持。病毒感染的細胞培養物對紅細胞的吸附作用很弱或沒有。
〖BT4〗3.培養 PPV隻能在來源於豬的細胞(包括原代豬腎、豬睾丸細胞和傳代係PK15)和人的某些傳代細胞(如Hela、KB、HEp2、Lu132等)中培養增殖，其中以原代豬腎細胞較為常用。 為了獲得大量的病毒和使細胞出現明顯的病變，要求在多數細胞處於旺盛的有絲分裂期進行病毒接種，不能象一般常規那樣，待細胞形成單層後才接種病毒。為此，可於培養細胞同時，最遲也不超過24小時，就進行病毒接種。當接種時機適當，病毒接種量又大時，病毒大量迅速增殖，於2～5天出現細胞病變，7～8天達到收獲程度。初期，細胞呈彌漫性顆粒樣變化，繼之發生圓縮和脫落，有時整個細胞層全部掉光。但接種時機過遲和接毒量太小時，往往看不到細胞病變，連續盲傳後，致細胞病變作用可以增強。 在感染的豬腎細胞核內，最早可於接種後18小時發現A型包涵體(HE染色)，其中存在大量的病毒粒子(圖37-3)。應用免疫熒光檢測包涵體，發現有病毒抗原存在。
4.病原性 長期以來，人們懷疑PPV是豬繁殖障礙和胎兒畸形的病原之一。病毒可通過胎盤引起胎兒感染。Mengeling應用豬胚腎原代細胞培養物，從屠宰場宰殺的98頭妊娠母豬中的3頭母豬的胎兒分離到了病毒；又從82窩經子宮切開術取胎並被剝奪初乳的新生仔豬中的3窩，檢出了高效價的血凝抑製抗體。此外，他還應用免疫熒光法從6個月木乃伊化的胎兒檢出了病毒抗原，隨後又用組織培養法分離出了病毒。據日本於1970～1974年的調查，本病毒引起的流產和死產多發於8～10月，且主要限於春、夏期間配種的初產母豬，因為經產豬多已發生感染免疫。流產可發生於全部妊娠期，但以妊娠中期前感染最為易發。 人工接種胎兒試驗表明，隨妊娠期的不同，感染結果有明顯差別。如據Bachmann等的資料(1975)，於妊娠後35、48和55天感染時，胎兒經5～22天死亡，並呈現木乃伊化，能從其髒器分離出病毒。於妊娠後72、94和105天感染時，胎兒不僅存活並產生高滴度的抗體。成年豬人工感染不呈現臨床症狀，幼齡仔豬人工感染後可能發生倦怠、食欲不振、嘔吐、下痢、跛行等症狀。自然情況下，也常能從健康豬中分離到病毒。這些都表明存在無症狀潛伏感染的豬。
5.流行病學 病毒能通過胎盤傳染給胎兒，形成垂直傳播，這已為很多實驗所證實。Lucas等(1974)在被感染的公豬睾丸內發現了病毒，並證明能通過交配傳染給母豬。病豬分泌液、排泄物及被其汙染的器具均可引起傳播。妊娠後期感染的胎兒雖出生後不見異常，但很可能成為傳染源。由於本病毒常呈潛伏狀態存在，故在進行正常組織培養時，往往出現這種病毒的汙染。 血清學調查表明PPV感染在豬群中普遍存在，90%以上的老母豬和78%的小母豬呈PPV抗體陽性。部分6～8月齡母豬在第一次懷孕時對PPV無免疫力。在一項調查中，30%的小母豬和公豬的PPV血凝抑製抗體(HI)滴度低於1∶32，說明被動免疫已經降低。相反，98%的成年母豬的HI滴度高於1∶256，它們已產生了主動免疫。新生仔豬從血清陽性母豬的初乳中可獲得較高水平的抗PPV抗體，但抗體滴度以後逐漸降低，到6～9月齡時，不能再檢出抗體。此時，第一次懷孕的小母豬如果遭受PPV感染，最容易發生繁殖障礙。
6.免疫據Mayr和Cartwright等的試驗資料，人工接種後，豬血清中於6～9天出現HI抗體，14～21天抗體滴度可達1024～5000倍。與接種豬密切接觸的健康豬也呈現同樣高的抗體滴度。由於70日齡以上胎兒感染時，在子宮內即可產生抗體，所以感染仔豬出生後，即可檢出很高水平的抗體，這也是本病的一個特點。抗體水平隨豬的年齡增長而逐漸下降。但由於本病毒與本屬其它病毒一樣具有潛伏感染的特性，位於局部的病毒，能不斷地刺激機體產生免疫反應，所以低水平的抗體可持續很長時期。除血凝抑製抗體外，中和抗體、補結抗體也經常出現在循環血液中。
7.診斷主要靠分離病毒和血凝抑製試驗。前者主要用於流產和死產胎兒，後者用於可疑病豬的診斷。
(1)病毒的分離和鑒定 通常采取可疑流產和死產胎兒的腎、肺、肝、腦、睾丸和胎盤等作為分離病毒的病料。從感染仔豬分離病毒時，以腸係膜淋巴結和肝髒的分離率最高。病料經研磨製成5～10倍乳劑，將離心後的上清接種於尚未形成單層的原代豬腎細胞或SK細胞係培養物內，也可與培養細胞同時接種。初次分離病毒時，一般不用PK15細胞係，因其不如前兩種細胞敏感。標本中病毒濃度較高時，於接種後24～72小時出現細胞病變，當大部細胞出現病變和脫落時收獲(如果細胞病變不明顯，可進行盲傳)。此時病毒濃度可達105～1065TCID50/02ml，血凝效價可達1∶1024。核內包涵體一般在接種後16～36小時出現。 用原代豬腎細胞培養分離病毒時，必須設不接種病料的空白對照培養，而且要盲傳3代，隻有當對照培養物正常，接種病料的培養瓶出現細胞病變時，才能判為病毒分離陽性，即病毒確係來自被檢標本，而非來自分離培養病毒用的豬腎細胞。 據一些研究者的資料，直接應用病料組織，如腎、肺和睾丸等進行單層細胞培養，較接種其它易感細胞更容易成功，但病料組織一定要新鮮無菌，才能達到目的。 本病毒隻有一個血清型，且與其它病毒不呈現交叉反應，所以應用已知標準免疫血清進行血清學反應，即可達到鑒定目的。其中以血凝抑製試驗最常應用，其次為中和試驗。簡易快速的方法是在組織培養分離病毒過程中，應用免疫熒光抗體染色法直接檢查單層細胞培養物，也可獲得滿意結果。 病毒培養物的血凝試驗，在病毒鑒定上也有重要參考價值。它能凝集豚鼠、恒河猴、人O型、新生雛雞、鵝、犬和小鼠的紅細胞，不凝集豬、馬、牛和兔的紅細胞，實驗室最常應用豚鼠紅細胞。利用一段PPVDNA序列，用同位素或非同位素標記物標記，製成核酸探針，從病料中檢測PPV是近年來發展的診斷方法，它明顯提高了診斷的敏感性和特異性。
(2)特異性抗體的檢驗 ①血凝抑製試驗：是最常用的血清學診斷法，可用試管或微量滴定板進行。血清先經56℃30分鍾滅活，然後用50%豚鼠紅細胞吸附除去血清中的非特異性凝集素，即可用於試驗。首先以緩衝鹽水對血清作倍比稀釋(可從4倍開始到4096倍)，然後向每個稀釋度的血清中加入等量的血凝抗原(含4個血凝單位)，混勻後室溫感作1小時後，加入等量的05%～10%豚鼠紅細胞懸液，混勻，放4℃下經4～6小時判定。同時設已知的陰、陽性血清對照。滴度1∶8以上判為陽性。感染豬能產生很高的血凝抑製抗體，最高可達4000倍以上。 ②中和試驗：可用SK細胞係或豬腎繼代細胞，采取血清稀釋法，同時設已知陰、陽性血清對照。病毒滴度約100TCID50/01ml。向經過滅活的不同稀釋度的血清管內，加入等量病毒懸液，混勻後放置2小時，取02ml分別接種3～4支培養管，在輕度振蕩下吸附1小時(37℃)，然後補足維持液，放旋轉鼓上或靜止培養，經5～10天判定。
8.預防 後備母豬進入繁殖群，常常成為易感個體，並因感染而發生繁殖失敗。所以將後備母豬群與經產母豬隔離能減少自然感染。應經常檢查種公豬的感染狀況，淘汰陽性公豬，因感染種公豬的精液帶毒可通過交配而傳播病毒。 ①自然感染免疫法：在存在本病的豬場，可以考慮采用自然感染免疫法，即在後備種豬群中放進一些血清陽性的經產母豬，或將後備母豬放在感染圈內飼養約1個月左右，使其受到自然感染而產生主動免疫力。此法的缺點是豬場長期遭受汙染。 ②免疫接種：由於PPV血清型單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控製PPV感染的一種行之有效的方法。於繁殖前給母豬接種疫苗是世界上大部分地區共用的方法。滅活疫苗、弱毒疫苗均可使用。
a.弱毒疫苗：PPV毒株NADL2在細胞培養上經過50多代已馴化成為一種活疫苗。將疫苗經口服、鼻內接種血清陰性的懷孕小母豬不引起胎兒感染，但子宮內接種對胎兒有致病性。與強毒株NADL8比較，1000倍的NADL2才能引起胎兒死亡。這種活疫苗在母豬繁殖前接種可產生免疫反應，保護強毒的攻擊。Fujisaki等(1978)將有毒力的PPV在低溫(30℃)豬腎細胞上傳54代，產生的變異株稱為HT，它接種豬後不產生病毒血症和排毒，但能誘導產生高滴度的抗體和較強的免疫力。將HT株再在豬腎細胞上培養並用紫外線照射後傳代，獲得了安全性和免疫原性更好的HTSKC株。 蔣玉雯等由廣西初產母豬所產死胎的內髒分離獲得1株自然弱毒株-N株。給1713頭後備母豬在配種前進行田間試驗，接種後HI抗體上升，免疫保護效果良好，母豬的產仔率、所產仔豬的成活率都明顯提高。
b.滅活疫苗：細胞培養的病毒用β丙內酯、福爾馬林、乙酰乙烯亞胺(AEI)以及二乙烯亞胺(BEI)滅活，加入佐劑如氫氧化鋁膠可製成滅活疫苗。用β丙內酯滅活病毒，加氫氧化鋁佐劑而製成的滅活疫苗可使豬產生HI抗體，至少持續4個月。第2針注射後在7天內產生強烈的回憶反應。疫苗在4℃保存6個月不降低免疫原性。Suzuki和Fujisaki(1976)用福爾馬林滅活病毒接種動物，誘導產生了高滴度的抗體。滅活疫苗安全，但人們對其產生免疫反應的效果有爭議，主要問題是青年豬低水平的母源抗體常常幹擾滅活疫苗接種的效果。 潘雪珠等應用PPV的豬睾丸細胞培養物，以AEI滅活，製成油佐劑疫苗。兩次注射的免疫應答反應可持續7個月以上。
上一篇：細小病毒屬(Parvovirus)
下一篇：貓泛白細胞減少症病毒
