三、PCR及相關技術
不同公司不同的酶要求的反應體係與反應條件會有不同，PCR反應可參考該酶的產品說明上的反應體係與反應條件。
一般的反應體係如：
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引物(50pmol/μl) |
各1μl 反應終濃度: |
各1pmol/μl |
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模板(約30ng/μl) |
1μl |
約30ng |
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Buffer(10´, 含Mg2+) |
5μl |
1´ |
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dNTPs(10mM) |
1μl |
0.2μM |
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高溫聚合酶(5U/μl) |
0.2～1μl |
1－5U |
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ddH2O |
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總體積 |
50μl
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PCR反應參考程序：
――――――――――――――――時間
Step 1 預變性 95-96℃ 3-8min
Step2 變性 94℃ 50sec
Step3 複性 ＊ 50sec
Step4 延伸 72℃ ＊
Step5 2、3、4步驟循環（25次左右）；
Step6 延伸 72℃ 10 min
4℃結束反應（4度長時間保溫對PCR儀有較大損傷，一般不超過1小時便及時取出，絕對不允許過夜保溫）。
注：
引物應該用專門的軟件（如Primer Premier）認真設計，注意兩條引物的Tm值大致相等，GC含量較均一，引物自身以及之間不形成強的二級結構，特別是引物的3’ 端，引物不和模板其他位置形成強的配對（主要看引物3’端）。
MgCl2濃度依不同的模板和引物而定。MgCl2的濃度對PCR結果影響很大。
鏈黴菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低複性溫度）其濃度可在0~10%之間變化。
模板為環形質粒時若一次沒有擴增出來，可以考慮先用酶將其切成線性再作。
對高GC含量的模板，預變性的時間也可適當延長，甚至先在沸水中煮5分種，然後迅速放入冰中。如果使用預變性溫度高或時間長，一般要使用“熱啟動”，即在預變性後再加入酶，這樣一是可以保護酶，二是可以避免低溫時酶的非特異性擴增。
現在的PCR儀一般都有“熱蓋”裝置，可以代替原來使用的礦物油，避免PCR過程中水份蒸發到管蓋上。
複性溫度依引物Tm值及引物與模板的匹配程度而定，提高複性溫度可提高擴增的特異性，而當無擴增條帶時，可適當降低複性溫度。
延伸時間可根據擴增區域的長度確定，擴增區域越長，延伸時間越長。不同的聚合酶的延伸速度不一樣，具體看說明書，一般高保真聚合酶平均每分鍾延伸600bp，普通Taq酶每分鍾延伸1kb。
根據不同需要使用不同的聚合酶，尤其當用於擴增表達的基因序列時，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR驗證時就可用普通Taq酶。以鏈黴菌或其他高GC含量的DNA作模板時，由於GC含量越高，模板和引物的二級結構越複雜，延伸和配對越難，PCR反應不好做，可以暫時（2003年7月－）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保證，但擴增效果很好。酶的用量可參考說明書，並不是越多越好。
LA Taq酶的GC buffer往往能用於別的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它們也能很容易地擴出高G+C的模板來。
PCR重組（詳見《PCR技術實驗指南》p429 重疊延伸技術）
注：1. 兩條模板的量無需太大，因盡量保證1:1。
2. 保證引物之間不會有幹擾
3. 四條引物的PCR重組比三條引物的 PCR橋重組容易操作。即分別設計引物對兩個模板進行擴增，使擴增後兩個模板有35-40bp的重疊序列，分別回收兩個模板在隻有兩條外引物的條件下進行常規PCR.
PCR定點誘變（DpnI法）
1. 引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp，設計的突變位點需位於引物中部。
2. PCR反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循環次數少，一般為12個循環。
反應體係：
10x pyrobest Buffer 5 ul
dNTP Mixture(10mM) 1ul
模板DNA(5~50ng) 1ul
primer 1 (125ng) 1ul
primer 2 (125ng) 1ul
pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul
加無菌蒸餾水至 50ul
3. PCR產物沉澱純化：加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20゜C冰箱）5min，離心棄上清，70~75%乙醇洗鹽兩次，烘幹後溶於無菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）
4. DpnI酶切： Buffer 2ul
BSA（100╳） 0.2ul
DNA x ul
DpnI 0.5ul
加無菌去離子水至 20ul
30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 終止反應。
5. 將酶切產物轉化大腸杆菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。
6. 測序驗證
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