鏈黴菌實驗操作7

從已經長好的固體培養基上用棉簽刮取孢子,使孢子懸浮於離心管中的無菌水中；將離心管放在振蕩器上盡可能地激烈振蕩1分鍾左右；用裝有脫脂棉的試管過濾懸液以除去菌絲片段和固體培養基碎片；3000轉／分離心5－10分鍾以使孢子沉澱，停止離心後馬上倒掉上清液；將離心管在振蕩器上振蕩幾秒鍾使孢子沉澱物分散於殘存的一點無菌水中；加入無菌的20%甘油於-20℃保存。

    鏈黴菌中的普通致育型因子（NF）能夠產生次甲基黴素，能將旁邊不攜帶NF的鏈黴菌殺死。將待證明鏈黴菌的孢子均勻的塗布在MS培養基表麵，待生長到開始產生孢子和抗生素後，將培養基和表麵的鏈黴菌用槍頭製成小圓塊，然後接到新鮮的預先均勻塗布了不具有NF的鏈黴菌孢子MS培養基表麵。於30℃培養觀察是否產生抑菌圈。抑菌圈的大小代表次甲基黴素的含量。

 

雜交試驗通常在R₂YE上進行,本實驗在MS上進行（趙麗雲）。首先收獲得到兩個親本LY1和LY2大量的孢子懸液，然後分別將兩親本含有10⁸ 的孢子懸液混合均勻後塗布在培養基表麵 ，於30℃培養直到產生孢子（4－10天）。按照“鏈黴菌孢子懸液的製備”的步驟收獲雜交後的孢子，得到的雜交後代是一係列基因型不同的重組子群。

1.       選擇合適的兩個親本：（1）一個親本帶有新基因，另一個不帶有，且可用一定的方法區分是否帶有新基因。（2）兩個親本具有好幾個互補的遺傳標記，如一個親本為his⁺另一個為his^-。

2.       將兩個親本進行孢子雜交

3.       重組子基因型的鑒定

通常，在特定的選擇性培養基上鑒定重組子的基因型，如在親本（1）pro^＋、his^＋、arg^＋、cys^＋、str^S、ura^＋和親本(2) pro^－、his^－、arg^－、cys^－、str^R、ura^－這兩個親本菌株-的雜交試驗中，首先將雜交後的孢子塗布在一個含有脯氨酸（P）、精氨酸（A）、半胱氨酸（C）、鏈黴素（S）和尿嘧啶（U）的MM培養基上，因而就選擇了從親本LY2傳來的str（鏈黴素抗性）性狀和由親本LY1傳來的his⁺（不需要組氨酸）性狀的重組子。然後挑選重組子菌落，用它們生長用的同樣的MM培養基製備母平板，待點種區菌落長成以後，把母平板再影印到一套五種“診斷培養基”上：（1）ACSU（不加P），（2）PCSU（不加A），（3）PASU（不加C），（4）PACS（不加U），（5）PACSU（對照平板）。複製平板經培養以後，每個重組子的基因型根據它們在每種培養基上是否生長而得到鑒定。

 

4.       遺傳圖譜的製作

本研究挑選了具有str（鏈黴素抗性）性狀和his⁺（不需要組氨酸）性狀的重組子172個，然後影印到五種“診斷培養基”上。172個重組子在五種“診斷培養基”上得到生長情況如下：在（1）ACSU（不加P）上生長了40個重組子；在（2）PCSU（不加A）上生長了46個；在（3）PASU（不加C）上生長了54個重組子；但在（4）PACS（不加U）上卻未發現有生長的重組；，在（5）PACSU（對照平板）172個重組子都生長了。根據172個重組子在五種“診斷培養基”上得到生長情況製作遺傳圖譜（圖3.4）。

 

 

圖3.4  LY1（原養型 Str^S NF SCE25AT bad-M145衍生菌株）（內圈）與LY2（proA1 hisC9 argA1 cysD18 uraA1strA1 NF SCE25AT bad+1258衍生菌株）（外圈）進行孢子雜交，選擇具有str^R和his⁺的性狀的重組子，其它標記用於計數。

 

5.       在遺傳圖譜上兩個標記基因之間定位新的基因

   在遺傳圖譜上兩個標記基因之間定位bad基因的過程大致如下：將重組子的基因型與親本LY1相比就可知，重組子上哪兩個標記間的染色體是來源於另一親本LY2。如果來源於LY2的那段染色體取代了LY1中含有bad基因的一段染色體，那麽得到的重組子就不具有bad基因。在鬆弛培養中，不具有bad基因的重組子中的bldA基因就可被SCE25AT置換掉，從而顯示“光禿”表型。結合重組子的基因型就可知bad基因在哪兩個相鄰的標記之間。