植物細胞組織培養

一．實驗目的

通過本實驗可初步掌握常規的組織培養技術，加深對無菌操作的了解。

 二．實驗原理

植物的全能性：植物體的任何一個細胞都具有生長分化成為一個完整植株的能力，稱為植物的全能性。

植物組織培養就是利用植物的全能性進行離體無菌植物培養的一門技術。

植物組織培養按其原始意義，就是指愈傷組織培養。但發展至今，其範圍日益擴大，已包括植物和它的離體器官、組織、細胞和原生質體的離體無菌培養。因此，擁有幾種不同水平的培養技術，即整體的、器官的、組織的、細胞的和原生質的培養技術。它們的涵義是：

1．植株培養。指以具備完整植株形態的材料（如幼苗和較大的植株）為外植體的無菌培養。

2．胚胎培養。指以從胚珠中分離出來的成熟或未成熟胚為外植體的離體無菌培養。

3．器官培養。指以植物的根，莖，葉，花，果等器官為外植體的離體無菌培養，如根的根尖和切段，莖的莖尖，莖節和切段，葉的葉原基，葉片，葉柄，葉鞘和子葉，花器的花瓣，雄蕊（花藥，花絲），胚珠，子房，果實等的離體無菌培養。

4． 組織培養。指以分離出植物各部位的組織（如分生組織，形成層，木質部，韌皮部，表皮，皮層，胚乳組織，薄壁組織，髓部等），或已誘導的愈傷組織為外植體的離體無菌培養。這是狹義的組織培養。

5．細胞培養。指以單個的遊離細胞（如用果酸酶從組織中分離的體細胞，或花粉細胞，卵細胞）為接種體的離體無菌培養。

6． 原生質體培養。指以除去細胞壁的原生質體為外植體的離體無菌培養。

本實驗選擇煙草和豌豆為材料，煙草（Nicotiana）屬茄科植物，是重要的工業原料，也是植物組織培養的四大典型實驗植物（煙草、矮牽牛、胡蘿卜、芸苔）中重要的一種，它的研究的最為廣泛，也始終領先於其他的植物材料，目前，66個煙草品種中，再生成植株的有16個種，通過花藥培養再生成花粉植株的有12個種，通過原生質體培養再生成植株的有20個種，通過煙草的種內和種間原生質體融合再生成雜種的植物分別為3個和12個種。豌豆（Pisum sativum）屬豆科植物，是糧食、飼料和重要的蔬菜作物，也是遺傳學家和植物生理學家感興趣和樂於采用的實驗植物，豌豆的根、莖、子葉、下胚軸、上胚軸、花芽等外植體，皆可形成愈傷組織，其中莖尖、幼胚、幼葉等器官可成功的再生成植株。莖尖培養可包括小至十幾微米的莖尖分生組織（生長點）和大至幾十毫米的莖尖或更大的芽培養。在實踐應用上，常采用生長點的培養使患病植物去病毒，以達到挽救優良品種，提高產量和質量之目的。

三．實驗材料

儀器設備

1．光照培養箱或溫室；

2．雙筒解剖顯微鏡；

3．酒精燈、100ml三角燒瓶，9厘米培養皿；

4．鑷子、剪刀、解剖針；

材料和試劑

1．材料  煙草無菌苗、豌豆幼苗。

2．試劑

（1）無菌水 

（2）MS培養基，植物激素：NAA、6-BA等；

（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；

（4）飽和漂白粉液（次氯酸鈉）；

四．實驗步驟

1．煙草無菌苗的快速切繁—繼代培養：（要求完全無菌操作）
每組一瓶煙草無菌苗，請細心操作，以免汙染。
（1） 在實驗台上，點著酒精燈，將雙手用酒精棉球擦拭消毒，打開生長好無菌煙草苗的三角瓶，三角瓶的瓶口使用前後需在酒精燈外焰上燒過滅菌。
（2） 用滅菌的鑷子輕輕捏出1株幼苗，用滅菌的剪刀將無菌苗剪成0.5-1厘米的小段，要求每段至少包含一個生長點，直接剪入盛有MS培養基的三角瓶中，每一個切段必須直接接觸培養基，三角瓶口重新燒過滅菌，並重新封好口。
（3） 在光照培養箱中15~25℃，16小時光照條件下培養4周，可長成完整植株，能用於田間移栽。
2．豌豆苗的莖尖培養
（1） 取發芽6天的豌豆幼苗10株，簡取1厘米左右的莖尖，浸入70%的酒精中1分鍾，再浸入飽和次氯酸鈉溶液中消毒15分鍾，（此步以後要求無菌）用無菌水中衝洗5次，在滅菌的濾紙上吸幹水分，放入滅菌的培養皿中。
（2） 在雙目解剖鏡下，用滅菌的解剖針剝去幼葉露出生長錐，用滅菌的解剖針挑取帶著兩至三個葉原基的生長錐。
（3）將挑好的莖尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸(NAA)+4.4μmol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培養基上誘導愈傷組織形成，用封口膜將培養皿封好。
（4）在恒溫培養箱中，26℃下,培養六周，形成愈傷組織，經繼代後，可用於生根培養。