房間空氣從前麵的開口處以0.38 m/s的低速率進入安全櫃，空氣經過工作台表麵，並經排風管排出安全櫃。定向流動的空氣可以將工作台麵上可能形成的氣溶膠迅速帶離實驗室工作人員而被送入排風管內。操作者的雙臂可以從前麵的開口伸到安全櫃內的工作台麵上，並可以通過玻璃窗觀察工作台麵的情況。安全櫃的玻璃窗還能完全抬起來，以便清潔工作台麵或進行其他處理。
安全櫃內的空氣可以通過HEPA過濾器按下列方式排出：（a）排到實驗室中，然後再通過實驗室排風係統排到建築物外麵；（b）通過建築物的排風係統排到建築物外麵；（c）直接排到建築物外麵。HEPA過濾器可以裝在生物安全櫃的壓力排風係統（the exhaust plenum）裏，也可以裝在建築物的排風係統裏。有些Ⅰ級生物安全櫃裝有一體式排風扇，而其他的則是借助建築物排風係統的排風扇。
Ⅰ級生物安全櫃是最早得到認可的，並且由於其設計簡單，目前仍在世界各地廣泛使用。Ⅰ級生物安全櫃能夠為人員和環境提供保護，也可用於操作放射性核素和揮發性有毒化學品。但因未滅菌的房間空氣通過生物安全櫃正麵的開口處直接吹到工作台麵上，因此Ⅰ級生物安全櫃對操作對象不能提供切實可靠的保護。
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