工業微生物產生菌的篩選（六）

（三）利用平皿的生化反應進行分離

這是一種利用特殊的分離培養基對大量混雜微生物進行初步分離的方法。分離培養基是根據目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產物生化反應來設計的。通過觀察微生物在選擇性培養基上生長狀況或生化反應進行分離，可顯著提高菌株分離純化的效率。

1. 透明圈法

在平板培養基中加入溶解性較差的底物，使培養基混濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產生菌時采用較多，如脂肪酶、澱粉酶、蛋白酶、核酸酶產生菌都會在含有底物的選擇性培養基平板上形成肉眼可見的透明圈。在分離澱粉酶產生菌時，培養基以澱粉為惟一碳源，待樣品塗布到平板上，經過培養形成單個菌落後，再用碘液浸塗，根據菌落周圍是否出現透明的水解圈來區別產酶菌株。如要分離該酸水解酶產生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養基上把懸浮液塗抹培養，等長出菌落後覆蓋一層營養瓊脂，內含3%酵母RNA，0.7%瓊脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，於42℃左右培養2～4h,四周產生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產生菌。

在分離某種產生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法進行初篩。在選擇性培養基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液塗抹到平板上進行培養，由於產生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產生菌時，由於乳酸是一種較強的有機酸，因此，在培養基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。

2. 變色圈法

對於一些不易產生透明圈產物的產生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產生菌時，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成後，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現絳紅色水解圈。在分離穀氨酸產生菌時，可在培養基中加入溴百裏酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色範圍在pH6.2～7.6，當pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。若平板上出現產酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可以從這些產酸菌中篩選穀氨酸產生菌。

在進行解脂微生物的分離時，雖然有很多精確的測定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由於步驟繁瑣，不適於大規模篩選測定。為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，如以吐溫為底物，尼羅藍（Nile blue）作為指示劑，根據變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測定。最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍和脂類底物混合，製成維多利亞藍乳脂瓊脂培養基平板，起始培養基調為中性，當土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的 菌落產生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應能顯示粉紅到藍色的變化。如培養基起始pH為堿性，則陽性解脂反應從咖啡色到藍綠色，能使脂類底物和解脂後的脂肪酸區別開來。後來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內倒一層營養瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利亞藍染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表麵，然後覆蓋一薄層含樣品的營養瓊脂，保溫培養，解脂菌落就可以在棉紙中產生藍帶。

分解解脂細菌的培養基（%）為：牛肉膏0.5、蛋白腖0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍4mg。

分離內肽酶產生菌，除了用酪蛋白作底物平板產生透明圈進行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養基中，產生蛋白酶的菌落由於水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，後者能氧化生成藍色產物，根據呈色圈便可選出平板上產蛋白酶的菌落。培養基平板由兩層組成，底層含明膠1.2％，酵母汁0.1％，蛋白腖0.4％，瓊脂1.5％，待凝固後在其上覆蓋一層瓊脂，瓊脂含量為0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩衝液配製，配製濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板。
通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類的瓊脂，該藍色物質在醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時）反應產生的電子脫色。因此生成乙醇的菌落便顯出一個淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產量。

3. 生長圈法

生長圈法通常用於分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產生菌。工具菌是一些相對應的營養缺陷型菌株。將待檢菌塗布於含高濃度的工具菌並缺少所需營養物的平板上進行培養，若某菌株能合成平板所需的營養物，在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個混濁的生長圈。如嘌呤營養缺陷型大腸杆菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上塗布含菌樣品保溫培養，周圍出現生長圈的菌落即為嘌呤產生菌。

同樣，隻要是篩選微生物所需營養物的產生菌時，都可采用生長圈法，工具菌用 相應的營養缺陷型菌株，由於得到所需營養，凡是目的微生物周圍便會出現混濁的生長圈。

4. 抑菌圈法

常用於抗生素產生菌的 分離篩選。通常抗生素的篩選要投入極大的人力、財力和時間。據估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的生產菌。因此設計一個準確、迅速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑製菌生長的 物質，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。采用該方法已經得到很多有用的抗生素，如春雷黴素和青黴素等。

在青黴素菌種選育中，還可利用加入青黴素酶來篩選青黴素高產菌株，做法如下：將產黃青黴孢子進行誘變處理，致死率約為99%。分離於瓊脂平板上，控製孢子濃度，使長成獨立菌落，一直培養到青黴素產量達到頂峰，加入0.106U/mol青黴素酶於鑒定菌枯草芽孢杆菌懸浮液中，鋪張於菌落平板表麵，凝固後，培養17～20h。測量抑菌圈大小，根據有效指標（抑菌圈直徑於菌落直徑之比）選出高產突變株。

由於現有抗生素種類多樣，得到新的抗生素越來越困難。人們除了從一些特殊的 地方如極端環境中采樣分離抗生素的 產生菌，也采用一些特殊的篩選方法，以期從普通土樣中分離篩選倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀釋法、擴散法、生物自顯影法等也不同程度的得到應用。在這些方法中，檢驗菌的選擇十分重要，直接關係到檢出的靈敏度和篩選到的抗生素的活性和抗菌譜。如在篩選抗細菌抗生素時，傳統上常用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作為檢驗菌來檢驗抗生素的抗性。采用聯合檢驗菌，如枯草杆菌和綠色產色鏈黴菌活巴氏梭菌，可分離出抗菌活性低、對其他試驗菌活性高的新抗生素，如黃色黴素族的抗生素，而這些抗生素在單獨使用枯草杆菌時無法檢出。

海洋是新抗生素的重要來源。許多海洋生物體內都含有微生物，這些微生物為宿主抵禦病害起著關鍵作用。因此，從魚組織和蝦消化道裏分離篩選抗癌藥物和抗炎症藥物是一個有效地途徑。已從水母體內篩到一種名為salinamide的抗生素，一種抗真菌抗生素istatin也從海洋生物體中分離出。

在篩選抗黴菌抗生素時，需根據其特點進行篩選，因黴菌與哺乳動物細胞性質相似，為減少藥物對人體的副作用，需挑選對黴菌有抗性但對人體安全的抗生素。由於哺乳動物不含幾丁質，因此可先篩選抑製幾丁質合成酶的生理活性物質，再從中篩選所需抗生素。三國黴素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的。抗病毒抗生素及抗腫瘤藥物的篩選則可通過敏感細菌培養平板的噬菌斑來判斷。

采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，而且還能篩選某些酶類。