簡介細菌的生理、生化試驗（上）

微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方麵不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一，微生物檢驗中常用的生化反應介紹如下：

一、糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。

試驗方法：以無菌操作，用接種針或環移取純培養物少許，接種於發酵液體培養基管中，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種後，置36±1.0°C培養，每天觀察結果，檢視培養基顏色有無改變（產酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產氣陽性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力，培養物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百裏藍和An-drade指示劑。

二、澱粉水解試驗

某些細菌可以產生分解澱粉的酶，把澱粉水解為麥芽糖或葡萄糖。澱粉水解後，遇碘不再變藍色。

試驗方法：以18~24h的純培養物，塗布接種於澱粉瓊脂斜麵或平板（一個平板可分區接種，試驗數種培養物）或直接移種於澱粉肉湯中，於36±1°C培養24~48h，或於20℃培養5天。然後將碘試劑直接滴浸於培養表麵，若為液體培養物，則加數滴碘試劑於試管中。立即檢視結果，陽性反應（澱粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。

澱粉水解係逐步進行的過程，因而試驗結果與菌種產生澱粉酶的能力、培養時間，培養基含有澱粉量和pH等均有一定關係。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。澱粉瓊脂平板不宜保存於冰箱，因而以臨用時製備為妥。

三、V-P試驗

某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，後者在強堿環境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。

試驗方法：

1.  O’Meara氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°C培養48h，培養液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置於室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內不呈現伊紅，即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h後判定結果者。

2.  Barritt氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置於室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

3.  快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放於小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜麵培養物一接種環，乳化接種於其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動後放置5min，判定結果。不產酸的培養物不能使用。

本試驗一般用於腸杆菌科各菌屬的鑒別。在用於芽胞杆菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。

四、甲基紅（Methyl Red）試驗

腸杆菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由於糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種於通用培養基，培養於36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

甲基紅為酸性指示劑，pH範圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應延長培養時間，重複試驗。

五、靛基質（Imdole）試驗

某些細菌能分解蛋白腖中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

試驗方法：將待試純培養物小量接種於試驗培養基管，於36±1°C培養24h時後，取約2ml培養液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮於培養液表麵後，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸麵呈紅色，即為陽性。

實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則隻有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。

六、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗

有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加於液體培養物或瓊脂斜麵培養物表麵，立即或於10min內呈現紅色即為試驗陽性，若無紅色出現則為陰性。

用α-萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入後應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應加注意。